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载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
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我用的是Petduet的载体，选用的是bamHI和Xhol的酶切位点，载体双酶切过，用以前的酶切产物链接并做了菌液PCR-MIx鉴定，是连上的，说明载体是挺好用的。 我需要连接一个1500bp的目的片段，也是B/X的酶切位点，可是试了很多次，菌液PCR几乎都没有阳性的克隆。平板上长的克隆也比较少，一般就三四个。 酶切体系40ul PCR产物 20ul 10 X H 4ul BamhI 1.5ul XholI 1.5ul ddH2O 13ul 酶切6~8小时，连接体系8ul，按照TAKARA 的 Solution I 说明书来连。 1个月了，还是没有构建成功。求助！很着急！  PetDuet-1 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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3楼2012-04-13 21:48:14
srlee
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amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
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zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
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总是连不上，因为酶切连接涉及的过程比较多，从LZ的表述来看： 1）首先确认载体酶切没有问题。你说以前有连上好用，但建议从新酶切质粒载体回收待用。 2）其次确认连接的目的片段酶切没有问题。设计引物时有没有加保护碱基？确认内切酶没有错误？PCR产物有没有纯化？建议将PCR产物纯化回收，定量后再进行酶切1-5ugDNA，然后再过柱纯化回收用于后面的连接。 3）再次，确认连接体系没有问题。连接前准确定量酶切好的载体和目的片段的浓度，根据浓度配制连接体系连接，有些人很喜欢用多少ul来定量，这是非常不准确的。 4）确认感受态没有问题。 如果以上问题都解决了，一般两天就会出结果。载体pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k应该是很好连的，祝实验顺利！ |
2楼2012-04-13 19:35:47
panda73
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【答案】应助回帖
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zh10008100: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:17
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首先，你的PCR产物的浓度是多少？一般，你的PCR产物大小为1500bp，酶切时总量有0.5ug就足够了。我估计你的20ulPCR的总量会远多于0.5ug，建议你在设计酶切反应前，对你的DNA样品进行定量。 另外，即使你酶切0.5ug，完全酶切你的PCR产物所需的XhoI为32U，所需的BamHI为大约6U。看来你的设计中XhoI加的量不太够，导致你的XhoI酶切不完全，因而克隆效率低。 而且建议你用BufferK可能更好些。 请注意：在切同一种DNA分子时，即使都是单切点，不同的酶所需的酶量也通常是不同。而且由于PCR产物通常比载体分子小很多（假定PCR的大小是载体的1/n），这时，完全酶切相同量的PCR产物比酶切载体所需的酶量要多n倍。 希望对你设计酶切有帮助。 |
4楼2012-04-13 23:17:29
5楼2012-04-14 12:45:54
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