| 查看: 2938 | 回复: 7 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
|
|||
|
我用的是Petduet的载体，选用的是bamHI和Xhol的酶切位点，载体双酶切过，用以前的酶切产物链接并做了菌液PCR-MIx鉴定，是连上的，说明载体是挺好用的。 我需要连接一个1500bp的目的片段，也是B/X的酶切位点，可是试了很多次，菌液PCR几乎都没有阳性的克隆。平板上长的克隆也比较少，一般就三四个。 酶切体系40ul PCR产物 20ul 10 X H 4ul BamhI 1.5ul XholI 1.5ul ddH2O 13ul 酶切6~8小时，连接体系8ul，按照TAKARA 的 Solution I 说明书来连。 1个月了，还是没有构建成功。求助！很着急！  PetDuet-1 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有258人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助哪位大侠给分析下涂料分层的问题
已经有25人回复
- 求助！！！关于zeta potential！强帖高奖励啦~~~
已经有6人回复
- 求助一个合成反应（难度大概在空间位阻）
已经有19人回复
- 求助PP塑料应力发白
已经有12人回复
- 2013考研求助
已经有10人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- PVA总是溶解不好，求助
已经有20人回复
- 求助一段德文翻译【有效期截止到3月22日】
已经有2人回复
- [求助]，U盘和内存卡退出时总是显示该设备正在使用。怎么办？
已经有5人回复
- 载体连接pcr片段一直连不上
已经有17人回复
- PCR产物与T载体连不上 求助
已经有29人回复
- 我用的是pMAL-m2载体，片段大小连不上！
已经有3人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
- 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决
已经有10人回复
- 【求助/交流】PEGFP-N1与目的条带连不上
已经有6人回复
- 【求助】观看PPS或者用迅雷下载，不久宽带连接就会自动断开，之后就再连不上了
已经有4人回复
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zh10008100: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:17
感谢参与，应助指数 +1
zh10008100: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:17
|
首先，你的PCR产物的浓度是多少？一般，你的PCR产物大小为1500bp，酶切时总量有0.5ug就足够了。我估计你的20ulPCR的总量会远多于0.5ug，建议你在设计酶切反应前，对你的DNA样品进行定量。 另外，即使你酶切0.5ug，完全酶切你的PCR产物所需的XhoI为32U，所需的BamHI为大约6U。看来你的设计中XhoI加的量不太够，导致你的XhoI酶切不完全，因而克隆效率低。 而且建议你用BufferK可能更好些。 请注意：在切同一种DNA分子时，即使都是单切点，不同的酶所需的酶量也通常是不同。而且由于PCR产物通常比载体分子小很多（假定PCR的大小是载体的1/n），这时，完全酶切相同量的PCR产物比酶切载体所需的酶量要多n倍。 希望对你设计酶切有帮助。 |
4楼2012-04-13 23:17:29
srlee
铁杆木虫 (小有名气)
- MolEPI: 7
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 4480.7
- 散金: 29
- 红花: 3
- 帖子: 222
- 在线: 511.1小时
- 虫号: 802845
- 注册: 2009-07-03
- 专业: 生物防治
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
|
总是连不上，因为酶切连接涉及的过程比较多，从LZ的表述来看： 1）首先确认载体酶切没有问题。你说以前有连上好用，但建议从新酶切质粒载体回收待用。 2）其次确认连接的目的片段酶切没有问题。设计引物时有没有加保护碱基？确认内切酶没有错误？PCR产物有没有纯化？建议将PCR产物纯化回收，定量后再进行酶切1-5ugDNA，然后再过柱纯化回收用于后面的连接。 3）再次，确认连接体系没有问题。连接前准确定量酶切好的载体和目的片段的浓度，根据浓度配制连接体系连接，有些人很喜欢用多少ul来定量，这是非常不准确的。 4）确认感受态没有问题。 如果以上问题都解决了，一般两天就会出结果。载体pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k应该是很好连的，祝实验顺利！ |
2楼2012-04-13 19:35:47
青菜小虫
银虫 (著名写手)
风居住的街道
- MolEPI: 5
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 1666.5
- 散金: 1249
- 红花: 29
- 帖子: 1111
- 在线: 352.2小时
- 虫号: 1332002
- 注册: 2011-06-27
- 性别: MM
- 专业: 病毒学
3楼2012-04-13 21:48:14
5楼2012-04-14 12:45:54
5