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leannele

金虫 (小有名气)

[交流] q-PCR总是污染

最近做q-PCR总是出现污染。本来是打算做最小浓度检测，10倍比稀释到了一定的浓度后就会出现平台，而且，我每次做实验都是有清水对照的，清水对照的Ct值也在30左右，与浓度稀释的平台期差不多。我把所有的东西都换掉，只能维持一次，下一次又是污染。我做实验还是挺小心的，实在是找不出原因了。请各位大侠帮忙，谢谢。
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1楼2012-04-09 16:51:58
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
leannele(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+3, 嗯........很厉害的大侠~ 2012-04-09 18:25:59
嗯.................
曾有某实验室问过老外这个问题，老外这样答曰，PCR各组分专用，枪头、枪也必需专用，勤换手套，实验服专用，准备模板、PCR体系制备、加样、PCR、结果分析必需分开区域进行，所有管子最好是螺帽式的，不能使用一般的ep管，因为开盖肯定有溅出，同样用前必需短暂离心..........你看看需要多细心吧
看你的情况，可能是交叉或前次PCR产物持续污染（具体叫啥的，好像是Carry-over式污染吧），请严格优化各个步骤，或针对持续污染使用带UDG的Taq酶
祝实验顺利 若有说错请高手指点
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2楼2012-04-09 17:06:03
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leannele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-09 17:06:03:
嗯.................
曾有某实验室问过老外这个问题，老外这样答曰，PCR各组分专用，枪头、枪也必需专用，勤换手套，实验服专用，准备模板、PCR体系制备、加样、PCR、结果分析必需分开区域进行，所有管子最好是螺 ...

刚刚看完大侠在其他帖子的发言，很受益啊。谢谢，谢谢，我打算换ep管，在超净台做实验了。
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3楼2012-04-09 17:13:25
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leannele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-09 17:06:03:
嗯.................
曾有某实验室问过老外这个问题，老外这样答曰，PCR各组分专用，枪头、枪也必需专用，勤换手套，实验服专用，准备模板、PCR体系制备、加样、PCR、结果分析必需分开区域进行，所有管子最好是螺 ...

刚刚看完大侠在其他帖子的发言，很受益啊。谢谢，谢谢，我打算换ep管，在超净台做实验了。
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4楼2012-04-09 17:13:54
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leannele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-09 17:06:03:
嗯.................
曾有某实验室问过老外这个问题，老外这样答曰，PCR各组分专用，枪头、枪也必需专用，勤换手套，实验服专用，准备模板、PCR体系制备、加样、PCR、结果分析必需分开区域进行，所有管子最好是螺 ...

刚刚看完大侠在其他帖子的发言，很受益啊。谢谢，谢谢，我打算换ep管，在超净台做实验了。
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5楼2012-04-09 17:15:02
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leannele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-09 17:06:03:
嗯.................
曾有某实验室问过老外这个问题，老外这样答曰，PCR各组分专用，枪头、枪也必需专用，勤换手套，实验服专用，准备模板、PCR体系制备、加样、PCR、结果分析必需分开区域进行，所有管子最好是螺 ...

刚刚看完大侠在其他帖子的发言，很受益啊。谢谢，谢谢，我打算换ep管，在超净台做实验了。
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6楼2012-04-09 17:15:18
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)
★
leannele(金币+1): 谢谢参与
ct32以上就可以忽律不计了。 另外，不知道你是不是用96孔板，如果是的话，建议你一次可以少做点，做3个样品就行。然后样品和水至少离3个孔以上的距离，这样就可以保证不污染了（即：ct>32）。
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10楼2012-04-09 20:40:58
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hejp03

至尊木虫 (著名写手)
★
leannele(金币+1): 谢谢参与
水灭菌一下就行了。另外枪头和EP管也灭菌，应该不会有问题
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11楼2012-04-09 23:28:48
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
leannele(金币+1): 谢谢参与
我觉得一定得使用带滤芯的枪头
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12楼2012-04-10 00:28:47
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晓风残月cl

新虫 (正式写手)
★
leannele(金币+1): 谢谢参与
一般ct值在18-30之间实验结果比较可行   我觉得你稀释的模板浓度有点低了  阴性对照出现典型的扩增  这个很正常   但是只要ct值>30    就基本上没问题了
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13楼2012-04-10 15:11:41
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q307078056

银虫 (正式写手)
★
leannele(金币+1): 谢谢参与
最近发现，作为溶剂的水也有注意点：
1、自来水做水源，过密理博的超纯水机后的水配液进行Q-pcr，不行~
2、屈臣氏做水源，过密理博的超纯水机后的水配液进行，一样不行
3、美国进口回来的某水源，直接进行配制，yeah~  pass！
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15楼2013-02-27 20:42:23
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ailingzhihun7楼
2012-04-09 17:46   回复  
leannele(金币+1): 谢谢参与
ailingzhihun8楼
2012-04-09 17:46   回复  
leannele(金币+1): 谢谢参与
ailingzhihun9楼
2012-04-09 17:46   回复  
liuleitcm14楼
2012-04-12 10:08   回复  
leannele(金币+1): 谢谢参与
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