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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 谁帮我算一下连接体系啊？？能教我一下吗？？
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蓝色大大

铁虫 (初入文坛)

[求助] 谁帮我算一下连接体系啊？？能教我一下吗？？

谢谢大家~~

market：DL2000。目的片段：1331bp。载体：2692bp
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1楼 2012-04-08 19:00:06
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蓝色大大

铁虫 (初入文坛)
第一次求助发帖，大家多多帮忙啊
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2楼2012-04-08 19:03:01
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蓝色大大

铁虫 (初入文坛)
大神捏？？？？？？？？？？？？？
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3楼2012-04-08 19:10:52
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好目的片段和酶切后的载体一起跑下胶以确定浓度 再考虑连接比例
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4楼2012-04-08 20:24:50
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-04-08 20:24:50:
最好目的片段和酶切后的载体一起跑下胶以确定浓度 再考虑连接比例

其实是楼主目的片段浓度太低看不到了吧
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5楼2012-04-09 09:32:01
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝色大大: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-04-09 10:54:02
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！我们做的时候一般载体和片段浓度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
连接体系是根据载体大小，目的片段大小，以及载体和目的片段的浓度确定的。有一个公式，[(ng of vector×Kb size of insert) ÷ Kb size of vector   ]×(insert : vector) = ng of insert。
需要注意的有几点，第一点是一般来说载体与片段比例在3/1--10/1之间， 载体和片段长度相差不大就用5/1,相差大就用8/1。但是并没有一个严格标准可以界定具体什么叫差别大什么叫差别不大，所以一次可以做两个体系，分别用两个不同的比例。
第二点要注意的是，片段和载体用量不要太少，否则连接效率会非常低一般是确定载体的量来算需要插入目的片段的量，载体的量在250 ng以上比较好，一两百也能用，但是太低就不行了。
第三点是连接体系最好不要加水，体系不够的话说的是可以用水补平，但是加水相当于人为稀释了，这样必然会降低连接效率。不够的体系可以稍微调整载体和目的片段的量。这样二者比例就不一定是严格的8/1,或者6/1这种严格的整数，但是没关系。
第四点是连接产物很宝贵的时候，转化时可以转化连接产物的一半，留一半备用。万一这次感受态做的不好不至于全军覆没还得从头来过。有备用连接产物就省事多了。只转化一半会导致阳性克隆减少，但是那么多克隆咱不是也只需要一个阳性的就行了吗。
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6楼2012-04-09 09:44:13
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zy_696969

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 金币+4, 鼓励应助！目的基因和载体算出个比例就好啦，不必引入单位来计算滴 2012-04-11 22:14:25
我们一般是这么做的：
1 先把目的基因和载体以同样的量上样跑胶（比如说都是3微升上样）
2 估算目的基因和载体的亮度比"X"
3 公式计算
回收的PCR产物片段（即目的基因）：回收的载体片段=10:1
目的基因：0.3×10^(-3)(pmol)×660×1331bp=263.538ng
载体：0.03×10^(-3)(pmol)×660×2692bp=53.3016ng
目的基因：载体=(263.538/53.3016)/(目的基因和载体的亮度比"X" )
4 确定连接体系
我们用的是T4连接体系 10微升，其中确定的是：
①10× T4 Buffer      1微升
②T4 DNA Ligase     0.4微升      
③目的基因和④载体按比例加入这个体系，如果不满10微升加⑤ddH2O加满即可。

[ Last edited by 西瓜 on 2012-4-11 at 22:12 ]
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7楼2012-04-09 15:08:38
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麻花13

新虫 (小有名气)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-11 22:15:00
最好的办法是，准确知道载体和目的基因的浓度，然后求出摩尔比，然后按照酶说明书，在其设定的体系中按比例加入载体和目的基因
当然，这需要实验室有相关可以测得基因浓度的仪器，比如酶标仪
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8楼2012-04-10 00:36:55
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xiangyunch

金虫 (小有名气)
AT克隆没必要严格按照比例来，加个4微升片段，剩余用水补充就成。一般没有问题
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9楼2012-04-11 01:40:53
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紫菱Kitty

金虫 (小有名气)
★
西瓜: 金币+1, 同感…… 2012-04-11 22:14:45
楼主真是浪费啊！跑一个样一个胶全用了，可以切一下嘛~嘿嘿
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梦随风万里，几度洪辰来去。人面桃花长相忆。又是一年春华成秋碧，莫叹明月笑多情。
10楼2012-04-11 20:12:10
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