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谁帮我算一下连接体系啊？？能教我一下吗？？
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谢谢大家~~ market：DL2000。目的片段：1331bp。载体：2692bp |
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 【分子生物】EPI帖 | 实验求助 | 实验交流 |
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2楼2012-04-08 19:03:01
3楼2012-04-08 19:10:52
4楼2012-04-08 20:24:50
gongeleven
铁杆木虫 (正式写手)
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5楼2012-04-09 09:32:01
超然渡陈
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
蓝色大大: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-04-09 10:54:02
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！我们做的时候一般载体和片段浓度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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蓝色大大: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-04-09 10:54:02
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！我们做的时候一般载体和片段浓度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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连接体系是根据载体大小，目的片段大小，以及载体和目的片段的浓度确定的。有一个公式，[(ng of vector×Kb size of insert) ÷ Kb size of vector ]×(insert : vector) = ng of insert。 需要注意的有几点，第一点是一般来说载体与片段比例在3/1--10/1之间， 载体和片段长度相差不大就用5/1,相差大就用8/1。但是并没有一个严格标准可以界定具体什么叫差别大什么叫差别不大，所以一次可以做两个体系，分别用两个不同的比例。 第二点要注意的是，片段和载体用量不要太少，否则连接效率会非常低一般是确定载体的量来算需要插入目的片段的量，载体的量在250 ng以上比较好，一两百也能用，但是太低就不行了。 第三点是连接体系最好不要加水，体系不够的话说的是可以用水补平，但是加水相当于人为稀释了，这样必然会降低连接效率。不够的体系可以稍微调整载体和目的片段的量。这样二者比例就不一定是严格的8/1,或者6/1这种严格的整数，但是没关系。 第四点是连接产物很宝贵的时候，转化时可以转化连接产物的一半，留一半备用。万一这次感受态做的不好不至于全军覆没还得从头来过。有备用连接产物就省事多了。只转化一半会导致阳性克隆减少，但是那么多克隆咱不是也只需要一个阳性的就行了吗。 |
6楼2012-04-09 09:44:13
zy_696969
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西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 金币+4, 鼓励应助！目的基因和载体算出个比例就好啦，不必引入单位来计算滴 2012-04-11 22:14:25
西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 编辑内容 2012-04-11 22:12
西瓜: 金币+4, 鼓励应助！目的基因和载体算出个比例就好啦，不必引入单位来计算滴 2012-04-11 22:14:25
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我们一般是这么做的： 1 先把目的基因和载体以同样的量上样跑胶（比如说都是3微升上样） 2 估算目的基因和载体的亮度比"X" 3 公式计算 回收的PCR产物片段（即目的基因）：回收的载体片段=10:1 目的基因：0.3×10^(-3)(pmol)×660×1331bp=263.538ng 载体：0.03×10^(-3)(pmol)×660×2692bp=53.3016ng 目的基因：载体=(263.538/53.3016)/(目的基因和载体的亮度比"X" )  4 确定连接体系 我们用的是T4连接体系 10微升，其中确定的是： ①10× T4 Buffer 1微升 ②T4 DNA Ligase 0.4微升 ③目的基因和④载体按比例加入这个体系，如果不满10微升加⑤ddH2O加满即可。 [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-11 at 22:12 ] |
7楼2012-04-09 15:08:38
8楼2012-04-10 00:36:55
xiangyunch
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9楼2012-04-11 01:40:53
紫菱Kitty
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10楼2012-04-11 20:12:10
