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杜越欧

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR的模板浓度

本人第一次做荧光定量PCR，得到的CT值不是很理想，查阅得CT值在18-22之间比较理想，想问一下，同一批实验，加看家基因的反应液中和加目的基因的反应液中的模板浓度可以不同么，以获得理想的CT值？
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1楼 2012-03-28 09:17:26
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回帖置顶 ( 共有1个 )

可帅儿

银虫 (正式写手)
杜越欧: 回帖置顶 2012-03-30 13:29:46
引用回帖:
6楼: Originally posted by 杜越欧 at 2012-03-29 15:50:11:
加了2微升，20微升体系

应该差不多了这个量，可以的话能稍微多一点。
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
7楼2012-03-29 16:44:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 欢迎常来~ 2012-03-28 18:41:14
首先 模板量必须加等量的，这样内参才能对目的基因相对定量啊。其次 正常的Ct值范围为18-30之间，最好为23左右。一般一个20ul的反应体系里模板量最大为1ug。
其次，不知楼主的Ct值是太高还是太低，若是太高，那么说明模板浓度太低，这样楼主可以在提RNA的时候调整RNA浓度；若是太低，说明模板浓度过高，楼主可以适当降低模板浓度。若是Ct值太低的话，楼主还可以做个浓度梯度，这样既可以得到引物扩增效率又可以得到在最佳Ct值下的模板浓度。这样就对自己的实验做到了心里有数，在以后的实验中也会事半功倍
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5楼2012-03-28 18:25:49
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-28 11:07:57
个人看法：
1. 没有说18-22个Ct值是合适的，我认为在35个Ct值前都能说明问题（当然能这里有涉及Ct值矫正或模板量、阙值等众多问题），只是30左右的Ct值需要多次实验确定稳定的数据结果后方可用
2. 为什么要内参和检测基因的模板浓度不同，如果不同了的话你如何去标准化你说有的样品？况且，浓度不同肯定涉及稀释过程，定量中多任何不必要的步骤都能带来操作误差导致不规范的统计结果。所以不明白你这个做法有什么意义
希望有所帮助，如有说错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-28 09:30:10
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普通回帖

杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-28 09:30:10:
个人看法：
1. 没有说18-22个Ct值是合适的，我认为在35个Ct值前都能说明问题（当然能这里有涉及Ct值矫正或模板量、阙值等众多问题），只是30左右的Ct值需要多次实验确定稳定的数据结果后方可用
2. 为什么要内参 ...

浓度不同是因为发现，管家基因的CT值还算理想，而目的基因的CT值就过高，但是最高的才29，照您的意思好像也不算高。那您的意思是不是只要做两三次数值稳定，只要在35以下就都可以啊？
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3楼2012-03-28 10:20:13
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可帅儿

银虫 (正式写手)
是不是模板量提取不足呢？反应体系里模板加多少啊？
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
4楼2012-03-28 16:09:55
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-03-28 16:09:55:
是不是模板量提取不足呢？反应体系里模板加多少啊？

加了2微升，20微升体系
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6楼2012-03-29 15:50:11
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-03-29 16:44:19:
应该差不多了这个量，可以的话能稍微多一点。

但是一次做的pcr都是一个模板一个浓度的，看家基因的CT值就很低在13-15之间，而目的基因的CT值却很高在28-30之间，这是怎么回事，到底模板浓度是高还是低啊？求解
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8楼2012-03-30 13:29:37
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 杜越欧 at 2012-03-30 13:29:37:
但是一次做的pcr都是一个模板一个浓度的，看家基因的CT值就很低在13-15之间，而目的基因的CT值却很高在28-30之间，这是怎么回事，到底模板浓度是高还是低啊？求解

是因为你的目的基因表达丰度低或者是你的引物质量不是很完美。建议你增加模板量的同时减少循环数
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9楼2012-03-30 15:03:08
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-30 15:03:08:
是因为你的目的基因表达丰度低或者是你的引物质量不是很完美。建议你增加模板量的同时减少循环数

循环数我一直用的都是40，减少的幅度大概多少呢，这样就能使目的基因和管家基因的ct值相近么？
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10楼2012-03-31 12:34:06
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