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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-31 13:32:47
引用回帖:
10楼: Originally posted by 杜越欧 at 2012-03-31 12:34:06:
循环数我一直用的都是40，减少的幅度大概多少呢，这样就能使目的基因和管家基因的ct值相近么？

出现你这种现象的原因要么是你引物没设计好，要么是你的基因在你的细胞系中表达丰度低。引物问题好解决，但我觉得更可能是你的基因在你的细胞中表达丰度低。你增加你的模板量，同时将循环数降低到30.也建议你做下二次PCR找找原因，即做普通PCR，然后以第一次PCR的产物为模板再做一次PCR。这样通过两次PCR的跑胶情况能验证是不是你引物的问题，或者是基因表达丰度的问题，祝楼主实验顺利
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11楼2012-03-31 12:44:34
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-28 18:25:49
首先 模板量必须加等量的，这样内参才能对目的基因相对定量啊。其次 正常的Ct值范围为18-30之间，最好为23左右。一般一个20ul的反应体系里模板量最大为1ug。
其次，不知楼主的Ct值是太高还是太低，若是太高，那么说 ...

你好，我最近打算做QpCR，模板是cDNA,当时反转录的时候是根据promega
的M-MLV逆转录酶说明书进行的，使用的RNA量是2ug。这样子我觉得出的cDNA浓度也是蛮大的，如果我接着做QPCR的话，大概需要稀释多少个梯度？还有RNA模板量2ug是不是有点多呢？ 由于是第一次要做Qpcr，所以好多不太懂的，谢谢解答!
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12楼2013-01-05 16:44:12
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by czcpudai at 2013-01-05 16:44:12
你好，我最近打算做QpCR，模板是cDNA,当时反转录的时候是根据promega
的M-MLV逆转录酶说明书进行的，使用的RNA量是2ug。这样子我觉得出的cDNA浓度也是蛮大的，如果我接着做QPCR的话，大概需要稀释多少个梯度？还有 ...

根据你提RNA时的浓度来定，反转录时RNA一般在1000左右吧，若提RNA浓度太高，在溶解时适当多加无酶水溶解。
既然你初次做，建议就当练手吧，调整你的cDNA浓度到1000左右
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13楼2013-01-05 20:13:00
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