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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR的模板浓度
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杜越欧

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR的模板浓度

本人第一次做荧光定量PCR，得到的CT值不是很理想，查阅得CT值在18-22之间比较理想，想问一下，同一批实验，加看家基因的反应液中和加目的基因的反应液中的模板浓度可以不同么，以获得理想的CT值？
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1楼 2012-03-28 09:17:26
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by czcpudai at 2013-01-05 16:44:12
你好，我最近打算做QpCR，模板是cDNA,当时反转录的时候是根据promega
的M-MLV逆转录酶说明书进行的，使用的RNA量是2ug。这样子我觉得出的cDNA浓度也是蛮大的，如果我接着做QPCR的话，大概需要稀释多少个梯度？还有 ...

根据你提RNA时的浓度来定，反转录时RNA一般在1000左右吧，若提RNA浓度太高，在溶解时适当多加无酶水溶解。
既然你初次做，建议就当练手吧，调整你的cDNA浓度到1000左右
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13楼2013-01-05 20:13:00
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-28 11:07:57
个人看法：
1. 没有说18-22个Ct值是合适的，我认为在35个Ct值前都能说明问题（当然能这里有涉及Ct值矫正或模板量、阙值等众多问题），只是30左右的Ct值需要多次实验确定稳定的数据结果后方可用
2. 为什么要内参和检测基因的模板浓度不同，如果不同了的话你如何去标准化你说有的样品？况且，浓度不同肯定涉及稀释过程，定量中多任何不必要的步骤都能带来操作误差导致不规范的统计结果。所以不明白你这个做法有什么意义
希望有所帮助，如有说错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-28 09:30:10
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-28 09:30:10:
个人看法：
1. 没有说18-22个Ct值是合适的，我认为在35个Ct值前都能说明问题（当然能这里有涉及Ct值矫正或模板量、阙值等众多问题），只是30左右的Ct值需要多次实验确定稳定的数据结果后方可用
2. 为什么要内参 ...

浓度不同是因为发现，管家基因的CT值还算理想，而目的基因的CT值就过高，但是最高的才29，照您的意思好像也不算高。那您的意思是不是只要做两三次数值稳定，只要在35以下就都可以啊？
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3楼2012-03-28 10:20:13
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可帅儿

银虫 (正式写手)
是不是模板量提取不足呢？反应体系里模板加多少啊？
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
4楼2012-03-28 16:09:55
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