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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我想将pcr片段转入大肠杆菌内
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 我想将pcr片段转入大肠杆菌内

我想将PCR片段转入大肠杆菌内，其他人都用的电击转化，我这做不了电击转化，化转可以吗？有这么做过的没呀？我转了两次，都没成功，有成功的没？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2012-03-27 01:13:01
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花生剥了壳

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-29 10:29:24
看来楼主是刚刚接触分子生物学，PCR转化到大肠杆菌是不可能随着菌的扩增而扩增的，它进入菌体后会被降解掉，因为它没有复制的相关元件！可以把pcr产物连接T载体之后转化到（可以热击也可以电击）大肠杆菌感受态中，才会出现相关的复制子。
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10楼2012-03-27 15:46:09
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+5, 谢谢呀 2012-03-27 09:16:47
先连T载体，氯化钙法就能转大肠杆菌，不需要电击转化。
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2楼2012-03-27 07:43:49
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hls85915

荣誉版主 (文坛精英)
不一定电击化
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4楼2012-03-27 08:04:15
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
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zhang8826857: 金币+1, 能，能，这个我有办法，就是不知道该咋转进去呀，不用电击可以吗 2012-03-27 09:13:54
PCR片段直接转入大肠杆菌中能表达吗？
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5楼2012-03-27 08:49:59
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+5 2012-04-10 13:54:26
1.要是制备感受态细胞，然后转化到细菌体内
2.通过基因枪试试呢
3.PEG介导应该也可以。。
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6楼2012-03-27 09:29:55
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
转入到大肠杆菌中打算怎么弄啊。。。
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7楼2012-03-27 09:34:28
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elon_ma

禁言 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
8楼2012-03-27 09:37:32
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cgspider

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+4 2012-04-10 13:54:37
买感受态细胞和T载体
1. 连接，将你的PCR片段连接到载体上；
2. 带有目的片段的载体转入感受态细胞；
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9楼2012-03-27 09:42:41
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我爱沈泉

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+3, 我这必须转片段呀，不能用载体呢，化转靠谱不？ 2012-03-27 18:34:02
使用T载体，然后冰浴30min  42度热击45s  再冰浴3min  加液体培养基  37度摇菌1h  涂板  长12h  挑菌划线  再培养8h  菌落PCR 验证
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11楼2012-03-27 16:30:17
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光树林

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
理论我都学习过。。。呵呵，就是没实践过
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13楼2012-03-27 17:12:15
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
转大肠用普通热击42℃转化完全够了，可以不用电转化的。
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14楼2012-03-29 09:21:35
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whb21

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做过大肠杆菌转化，用的是氯化钙处理的感受态细胞，实验的成败关键在于感受态细胞，细胞给力，结果就很好。
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15楼2012-03-29 09:45:18
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yingyabin

金虫 (小有名气)
也来学学，虚心聆听
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16楼2012-03-29 10:10:31
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胖胖二妮子

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
连接到载体上，再用CaCl2感受态热激转化，42度90秒，冰浴两分钟
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17楼2012-03-29 10:25:33
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原野漫漫

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
18楼2012-03-29 21:55:29
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谢铮

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把PCR片段连到质粒上，因为质粒才能在细菌体内自主复制。
然后用冷钙法将质粒转化到感受态细胞内。
感受态可以自己做，也可以买到。
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19楼2012-03-30 13:17:06
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
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zhang8826857: 金币+1, 几乎所有人都会质疑啊，呵呵，我自有办法不让片段被降解的 2012-03-30 15:07:59
必须将pcr产物连接至相应载体才可以转化，这样才能在宿主菌里面复制目的片段。。。。。
楼主，你的版主是如何当起来的。。。。质疑。。。
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20楼2012-03-30 14:53:26
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简单回复
albert75283楼
2012-03-27 08:01   回复  
zhang731112楼
2012-03-27 16:56   回复  
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