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dzwd

金虫 (小有名气)

[求助] tail-PCR问题，求指导

第一次做有特异条带。同一条件，重复了两次都没有特异条带。是操作问题吗？应该在哪方面改进？高手指点下吧
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-03-24 19:21:26
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回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 有条有理~普通PCR重复性是不错，tail-PCR有时候真就看人品。。 2012-03-25 16:13:49
dzwd: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 谢谢啊 2012-03-25 21:57:38
嗯.......
不是说没有原因，而是你这种情况，原因可能太多，我们一般认为如果能做出来一次，就说明体系和程序是木有问题的，重复不出来的话，我们会考虑：
    1. 引物降解、dNTP降解等，所以会把体系都换一遍
    2. 模板也降解，重新提取后再做
    3. 机子最近出了问题，换别人的机子试试
    4. TAIL-PCR本来一次时间就要3-4个小时、如果你第一轮扩增时间过长，酶能不能抗住也还是问题呢
    5. 实在不行，就回去暴吃一顿、蒙头睡一觉，心情好些再继续
PCR本来就是概率时间，就算什么都优化了完美了，也不一定100%重复出来哦
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Let God do with it as He wills
6楼2012-03-25 09:12:27
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流！PCR是很神奇…… 2012-03-25 16:12:20
呵呵呵呵呵呵
同一条件，重复不出来，很正常啊，你需要考虑人品、机子、样品降解等各种因素哦，把所有能换的东西都换成新的，再P一下 P不出来的话，回去睡一觉，休息两三天，默默攒点人品，就会出来了，嘿嘿
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-24 19:32:22
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wocooo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这第一次是指的什么 第一轮扩增？
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3楼2012-03-24 23:38:06
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wocooo at 2012-03-24 23:38:06:
你这第一次是指的什么 第一轮扩增？

不是，是第一次做。第一次完整PCR之后，发现有条带。重复两次后发现没有了。
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4楼2012-03-25 08:34:20
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-24 19:32:22:
呵呵呵呵呵呵
同一条件，重复不出来，很正常啊，你需要考虑人品、机子、样品降解等各种因素哦，把所有能换的东西都换成新的，再P一下 P不出来的话，回去睡一觉，休息两三天，默默攒点人品，就会出来了，嘿嘿

没有原因的吗？
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5楼2012-03-25 08:34:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dzwd: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-25 21:58:01
很正常，TAIL-PCR有时靠运气，
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jiayoubashaonian
7楼2012-03-25 11:36:23
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aoaoshch

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多加点模板DNA试试吧。换别的随机引物试试，TaKaRa的比较好用。TAIL有时候就要运气的。把你的PCR产物保存好，以备下轮使用。GOOD LUCK !
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8楼2012-03-26 21:45:21
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个真是不好说原因，也有的前几次都出不来，重复几次就出来了，没有为什么啊。说不定是你后两轮的模板稀释的不够多
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9楼2012-03-26 22:49:12
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caidan1385

新虫 (初入文坛)
请问你做Tail-PCR时，3~4个简并引物是混合在一起与左臂或右臂特异性引物进行pcr反应的还是每个简并引物都要与左臂或右臂特异性引物单独反应啊？求指点下，谢谢了
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10楼2012-05-23 12:53:30
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