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融合蛋白纯化问题
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| 我的蛋白表达时是以包涵体的形式存在，可用4M尿素溶解，离心得到上清。将这个上清溶液与镍柱结合时，发现镍柱成絮状了。而且按照普通步骤洗脱一遍后，发现结合力很低。我的平衡溶液是20mM Tris，0.5MNacl， 4 M 尿素，PH8.0。除了咪唑浓度不一样以外，其他的都一样。请知道虫友分析下原因吧，谢谢分析下原因吧，谢谢 |
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【答案】应助回帖
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我首先想到的是你的包涵体的变性溶解与复性的收率太低， 我从国外实验室下载的一个实验流程，你可参考： Purification of inclusion bodies and refolding of proteins http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html |
2楼2012-04-28 22:51:00
imyting
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【答案】应助回帖
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不知道你的镍柱有没有再生过呢？你在上样之前有没有平衡啊？我还不太清楚你处理时的一些细节部分。 1.再生过，那么你在加完镍之后有没有用水洗干净啊？镍在碱性环境下会形成氢氧化镍絮状沉淀；此外，镍柱变成絮状是在平衡的时候还是在上样的时候呢？平衡时变成絮状可能就是镍没洗干净，若是平衡时没问题，上样时变絮状可能就是你的样品有问题了；样品的问题主要有是否过滤、有没有巯基乙醇之类的污染等； 2.没有再生过，如果是新的镍柱第一次使用，那估计也是样品的问题；如果是用过几次的，有可能前面的人用完没有用高浓度咪唑洗干净；此外你们的柱子不会共用吧？若是共用尽量用一样的洗脱液，不然也会有影响的。 3.实在解决不了问题的话，就再生一次吧，虽然对填料会有所损害，但是也灭办法了。 |
3楼2012-04-29 09:58:25
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