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jamy1989木虫 (小有名气)
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信号分子
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| 现在从链霉菌中表达出了一种调控蛋白并提纯了，通过验证这种调控蛋白能和基因 D结合，结合后能调节该菌株次级代谢产物的产生，但这种结合必须是在加培养液上清的条件下！所以上清中必然存在着某种信号分子，那么，现在要找到这种信号分子有什么好的方法吗？ |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | 蛋白质生物学实验经验 | 细胞生物学实验经验 |
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jamy1989
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12楼2012-05-19 18:49:22
jamy1989
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13楼2012-05-19 18:49:35
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 厉害！ 2012-05-20 18:37:56
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 厉害！ 2012-05-20 18:37:56
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更正一下： 你现在已知的蛋白质是在细胞里结合DNA的基因D，很可能是个转录因子，那么用上贴的招数就不对了，那招用于产生第二信使的膜蛋白质。但是办法可以借鉴，你可以用结合基因D的那种蛋白质（假定为蛋白质X）作为诱饵固定在层析柱上，用产生目的信号的细胞粉碎后过柱，看蛋白质X与那些成分结合（假设蛋白质X结合的特定蛋白质叫蛋白质Y），然后洗脱，即Pull-down,进一步用蛋白质-蛋白质相互作用方法研究两者的相互作用，最简单的是直接用电镜观察或者用原子力显微镜观察，或者用红外紫外荧光光谱分别测定两者游离时和混合均匀静置后的光谱变化，如果有专门软件可以用于解析出蛋白质X与蛋白质Y结合前后的二级结构变化，如果要精细些，也可以用NMR解析出蛋白质X与蛋白质Y结合前后的结构及其变化。如此再用蛋白质Y作为bait去钓取更靠近细胞膜或者就在膜上的与蛋白质Y相互作用的蛋白质，直到建立起完整的信号通路。 |
17楼2012-05-19 21:15:03
凌波丽
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 辛苦辛苦~学习了！ 2012-05-20 18:38:45
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 辛苦辛苦~学习了！ 2012-05-20 18:38:45
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你的课题，使用pull-down钓取未知蛋白质肯定会有假象，要注意几点：1.与信号通路相关的蛋白质必须是在特定信号通路激活时必然以活性方式出现在通路中的，这时要在特定信号通路激活时粉碎细胞，并且用此时的细胞提取液进行pull-down；2.注意亚细胞定位关系，因为粉碎了细胞，原有的细胞区室不存在了，所以bait蛋白质能够特意相互作用的蛋白质，首先考虑吊在pull-down时bait蛋白质必须要在特定细胞信号通路存在时处于bait蛋白质处于同一细胞区室，并且能够与bait蛋白质发生相互作用（处于激活状态）；3.特定细胞信号通路不存在时，要能确定该种能够与bait蛋白质发生相互作用并且处于同一信号通路中的蛋白质不能够与bait蛋白质发生相互作用，或者两者处在不同的细胞区室中或者两者之一不处于激活状态（首先考虑磷酸化和其他蛋白质结合）；4.如果以上努力仍然有多个蛋白质与bait蛋白质结合，那么考虑亲和力大小，首先考虑亲和力大的可能是与bait蛋白质在同一信号通路，亲和大小比较最简单就是用洗脱液的梯度加以比较，蛋白质-蛋白质相互作用主要是疏水相互作用。 5.到此就完了事吧？没有完事！即使时只确定与bait蛋白质在同一信号通路中的却与bait蛋白质直接相互作用的蛋白质到此也没有完事！因为不能确定与bait蛋白质亲和力最大的蛋白质就一定是与bait蛋白质处于同一信号通路（且这必须是在信号通路发生必定能够相互作用的前提下），因为至少不能说与bait蛋白质亲和力不是最大的那些蛋白质（如果的确存在，而且在信号通路发生必定能够相互作用）就一定不是与bait蛋白质处于同一信号通路，也就是说我们还不能确定bait蛋白质在特定信号通路中在一个信号传递方向上只有一个蛋白质唯一地与它直接地相互作用！那怎么办？最简单用基因敲除，分别敲掉可能bait蛋白质处于同一信号通路的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质，看看信号通路是否发生？这是个办法，不过太麻烦，而且万一哪种蛋白质特关键，一去掉细胞就挂了怎么办？用不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的抗体分别注入细胞，看看细胞的特定信号通路会不会发生，或者用RNAi或者反义RNA分别干扰不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的基因表达，看看细胞的特定信号通路会不会发生。 蛋白质之间的相互作用研究技术简介 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4425493&page=1#pid3 （改了一点文字错误，不知道我的叙述你是否看懂了？） |
20楼2012-05-19 21:51:33
凌波丽
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, 牛~ 2012-05-22 08:23:18
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, 牛~ 2012-05-22 08:23:18
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我再告诉你一种更简单的和更直接研究蛋白质-蛋白质相互作用的试验方法，用Biocongation方法，即把用有关的交联剂把能够相互作用的蛋白质接到一起。相互作用必须要彼此靠的足够近，最是使用一种双功能交联剂把两种相互作用的蛋白质连接起来，可以在细胞外进行，如果有能够穿过膜的交联剂也可以在细胞中进行--------如果要在细胞中进行，那当然就省事多了，最好使用光激活试剂，在诱导你要研究的信号途径出现时，用特定波长的光照射（比如紫外光）已激活交联反应，这样相互作用的蛋白质就黏在一起了，之前最好给已知的与基因D相互作用的蛋白质加个Label，比如绿色荧光蛋白，这样就很容易知道谁与该蛋白质发生相互作用了，并很容易分离出来。如此可以循环下去，直至建立全部的特定细胞信号通路。 如果这样的试剂不好找，那么也可在细胞外进行。在诱导出现特定信号传导时，冷冻并且粉碎细胞，然后将细胞裂解液混入足够的一起提纯的已知的与基因D相互作用的蛋白质（简称为蛋白质X），事先给蛋白质X构建一种亲和标签（比如His6）用电磁搅拌器温和地在现特定信号传导时的温度下搅拌，而后加入一种支链氨基酸和EDC（碳二亚胺，催化羧基与氨基形成酰胺键），0-4度过夜电磁搅拌器温和搅拌，第二天走Ni亲和层析柱，由His6的蛋白质X就被揪出来，而与蛋白质X相互作用的蛋白质也有不少共价连接上了要与之相互作用的未知的在同一信号通路中的蛋白质也就一起就出来了。 |
24楼2012-05-20 20:31:12
a731705125
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3楼2012-03-17 14:56:16
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| "验证蛋白质和DNA结合试验是通过凝胶阻滞（EMSA）来实现的！"???DNA-Protein interaction的研究技术方法多了去了！电子显微镜直接观测、NMR、DNA-Protein共结晶后X-ray diffraction、能量转移、足迹法、干扰法、光活化的特异性位点的DNA-Protein交联反应、原子力显微镜液相直接观测、全内放射光学显微镜观测等，你具体可以参考：·Tom Moss and Benoit Leblanc edit,DNA-Protein Interaction-----Principles and Prtocols,Huamna Press,2009. |
14楼2012-05-19 20:43:19
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西瓜: 金币+4, Good！ 2012-05-20 18:37:25
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"第二种“高通量”的话，因为这个信号分子本身就是很微观的东西！很难提取出来！可能是一个多肽，可能是一些无机离子等....可否有别的方法呢？"你怎么知道很难提出来！？从蛋白质等大分子中去除掉金属离子或类似分子量的小分子用什么办法？？-----------最简单的用Millipore超滤离心管装上培养剂溶液上离心机进行离心，只不过，你把Millipore超滤离心管底部甩出的液体不要扔掉，做个原子光谱分析和红外光谱，根据特征光谱大致可以判明有哪些常见的物质，然后用超滤的培养剂溶液适当稀释后，再培养细胞看看反应，还可以把Millipore超滤离心管底部甩出的液体加回培养基看细胞的反应。 这步无效，用成分差别大的培养基培养细胞，看看目的信号超导是否出现，对比两者成分。 |
15楼2012-05-19 20:51:54
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就你的课题，使用pull-down钓取未知蛋白质肯定会有假象，要注意两点：1.与信号通路相关的蛋白质必须是在特定信号通路激活时必然以活性方式出现在通路中的，这时要在特定信号通路激活时粉碎细胞，并且用此时的细胞提取液进行pull-down；2.注意亚细胞定位关系，因为粉碎了细胞，原有的细胞区室不存在了，所以bait蛋白质能够特意相互作用的蛋白质，首先考虑吊在pull-down时bait蛋白质必须要在特定细胞信号通路存在时处于bait蛋白质处于同一细胞区室，并且能够与bait蛋白质发生相互作用（处于激活状态）；3.特定细胞信号通路不存在时，要能确定该种能够与bait蛋白质发生相互作用并且处于同一信号通路中的蛋白质不能够与bait蛋白质发生相互作用，或者两者处在不同的细胞区室中或者两者之一不处于激活状态（首先考虑磷酸化和其他蛋白质结合）；如果以上努力仍然有多个蛋白质与bait蛋白质结合，那么考虑亲和力大小，首先考虑亲和力大的可能是与bait蛋白质在同一信号通路，亲和大小比较最简单就是用洗脱液的梯度加以比较，蛋白质-蛋白质相互作用主要是疏水相互作用。 到此就完了事吧？没有完事！即使时只确定与bait蛋白质在同一信号通路中的却与bait蛋白质直接相互作用的蛋白质到此也没有完事！因为不能确定与bait蛋白质亲和力最大的蛋白质就一定是与bait蛋白质处于同一信号通路（且这必须是在信号通路发生必定能够相互作用的前提下），因为至少不能说与bait蛋白质亲和力不是最大的那些蛋白质（如果的确存在，而且在信号通路发生必定能够相互作用）就一定不是与bait蛋白质处于同一信号通路，也就是说我们还不能确定bait蛋白质在特定信号通路中在一个信号传递方向上只有一个蛋白质唯一地与它直接地相互作用！那怎么办？最简单用基因敲除，分别敲掉可能bait蛋白质处于同一信号通路的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质，看看信号通路是否发生？这是个办法，不过太麻烦，而且万一哪种蛋白质特关键，一去掉细胞就挂了怎么办？用不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的抗体分别注入细胞，看看细胞的特定信号通路会不会发生，或者用RNAi或者反义RNA分别干扰不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的基因表达，看看细胞的特定信号通路会不会发生。 蛋白质之间的相互作用研究技术简介 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4425493&page=1#pid3 |
18楼2012-05-19 21:48:14
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5楼2012-05-10 10:50:59
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小丹木木: 金币+3, 丽美眉，欢迎欢迎 2012-05-18 15:22:33
jamy1989: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-19 11:58:17
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jamy1989: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-19 11:58:17
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这实际上是在搜索某种功能分子，甚至不知道其为生物大分子，还是有机或无机小分子。基本方法就是两个：比对和高通量。 比对，就是想法确定目的调控蛋白能和基因 D不结合的培养基与结合时的成分不同之处，你可以逐一去掉培养基有关成分试一试；高通量最好用光谱分析，可用红外光谱，根据特征峰定性查看信号分子大致是什么，然后根据分子量大小提取出来加以鉴定。 鉴定方法很多了，有机和无机小分子，一般用红外和原子吸收光谱就可基本上搞定，生物大分子可能要用MS，NMR等。 |
6楼2012-05-18 12:09:04
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