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jamy1989木虫 (小有名气)
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信号分子
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| 现在从链霉菌中表达出了一种调控蛋白并提纯了，通过验证这种调控蛋白能和基因 D结合，结合后能调节该菌株次级代谢产物的产生，但这种结合必须是在加培养液上清的条件下！所以上清中必然存在着某种信号分子，那么，现在要找到这种信号分子有什么好的方法吗？ |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, 牛~ 2012-05-22 08:23:18
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, 牛~ 2012-05-22 08:23:18
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我再告诉你一种更简单的和更直接研究蛋白质-蛋白质相互作用的试验方法，用Biocongation方法，即把用有关的交联剂把能够相互作用的蛋白质接到一起。相互作用必须要彼此靠的足够近，最是使用一种双功能交联剂把两种相互作用的蛋白质连接起来，可以在细胞外进行，如果有能够穿过膜的交联剂也可以在细胞中进行--------如果要在细胞中进行，那当然就省事多了，最好使用光激活试剂，在诱导你要研究的信号途径出现时，用特定波长的光照射（比如紫外光）已激活交联反应，这样相互作用的蛋白质就黏在一起了，之前最好给已知的与基因D相互作用的蛋白质加个Label，比如绿色荧光蛋白，这样就很容易知道谁与该蛋白质发生相互作用了，并很容易分离出来。如此可以循环下去，直至建立全部的特定细胞信号通路。 如果这样的试剂不好找，那么也可在细胞外进行。在诱导出现特定信号传导时，冷冻并且粉碎细胞，然后将细胞裂解液混入足够的一起提纯的已知的与基因D相互作用的蛋白质（简称为蛋白质X），事先给蛋白质X构建一种亲和标签（比如His6）用电磁搅拌器温和地在现特定信号传导时的温度下搅拌，而后加入一种支链氨基酸和EDC（碳二亚胺，催化羧基与氨基形成酰胺键），0-4度过夜电磁搅拌器温和搅拌，第二天走Ni亲和层析柱，由His6的蛋白质X就被揪出来，而与蛋白质X相互作用的蛋白质也有不少共价连接上了要与之相互作用的未知的在同一信号通路中的蛋白质也就一起就出来了。 |
24楼2012-05-20 20:31:12
西瓜
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帮顶下~2楼2012-03-17 14:35:23
a731705125
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jamy1989
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4楼2012-03-17 21:59:09