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jamy1989木虫 (小有名气)
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信号分子
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| 现在从链霉菌中表达出了一种调控蛋白并提纯了，通过验证这种调控蛋白能和基因 D结合，结合后能调节该菌株次级代谢产物的产生，但这种结合必须是在加培养液上清的条件下！所以上清中必然存在着某种信号分子，那么，现在要找到这种信号分子有什么好的方法吗？ |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 辛苦辛苦~学习了！ 2012-05-20 18:38:45
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 辛苦辛苦~学习了！ 2012-05-20 18:38:45
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你的课题，使用pull-down钓取未知蛋白质肯定会有假象，要注意几点：1.与信号通路相关的蛋白质必须是在特定信号通路激活时必然以活性方式出现在通路中的，这时要在特定信号通路激活时粉碎细胞，并且用此时的细胞提取液进行pull-down；2.注意亚细胞定位关系，因为粉碎了细胞，原有的细胞区室不存在了，所以bait蛋白质能够特意相互作用的蛋白质，首先考虑吊在pull-down时bait蛋白质必须要在特定细胞信号通路存在时处于bait蛋白质处于同一细胞区室，并且能够与bait蛋白质发生相互作用（处于激活状态）；3.特定细胞信号通路不存在时，要能确定该种能够与bait蛋白质发生相互作用并且处于同一信号通路中的蛋白质不能够与bait蛋白质发生相互作用，或者两者处在不同的细胞区室中或者两者之一不处于激活状态（首先考虑磷酸化和其他蛋白质结合）；4.如果以上努力仍然有多个蛋白质与bait蛋白质结合，那么考虑亲和力大小，首先考虑亲和力大的可能是与bait蛋白质在同一信号通路，亲和大小比较最简单就是用洗脱液的梯度加以比较，蛋白质-蛋白质相互作用主要是疏水相互作用。 5.到此就完了事吧？没有完事！即使时只确定与bait蛋白质在同一信号通路中的却与bait蛋白质直接相互作用的蛋白质到此也没有完事！因为不能确定与bait蛋白质亲和力最大的蛋白质就一定是与bait蛋白质处于同一信号通路（且这必须是在信号通路发生必定能够相互作用的前提下），因为至少不能说与bait蛋白质亲和力不是最大的那些蛋白质（如果的确存在，而且在信号通路发生必定能够相互作用）就一定不是与bait蛋白质处于同一信号通路，也就是说我们还不能确定bait蛋白质在特定信号通路中在一个信号传递方向上只有一个蛋白质唯一地与它直接地相互作用！那怎么办？最简单用基因敲除，分别敲掉可能bait蛋白质处于同一信号通路的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质，看看信号通路是否发生？这是个办法，不过太麻烦，而且万一哪种蛋白质特关键，一去掉细胞就挂了怎么办？用不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的抗体分别注入细胞，看看细胞的特定信号通路会不会发生，或者用RNAi或者反义RNA分别干扰不同的经过Pull-down筛选的剩下的几种蛋白质的基因表达，看看细胞的特定信号通路会不会发生。 蛋白质之间的相互作用研究技术简介 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4425493&page=1#pid3 （改了一点文字错误，不知道我的叙述你是否看懂了？） |
20楼2012-05-19 21:51:33
西瓜
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帮顶下~2楼2012-03-17 14:35:23
a731705125
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