【答案】应助回帖

qwdr

21楼2012-05-20 15:43:07

jamy1989

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19楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-05-19 21:49:22:
我们可以继续讨论，不过我不懂，同一内容的回帖你为何发了多次？

点了一下，网页没跳转，以为没发上去，就点了好多次，后来才知道！看了你的回帖，受益匪浅！小生先谢过了！

qwdr

22楼2012-05-20 15:45:40

凌波丽

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21楼: Originally posted by jamy1989 at 2012-05-20 15:43:07:
这个方法我也考虑过，可以试一下，就是怕挂的不紧，被洗脱掉！

分梯度洗脱就是了。

23楼2012-05-20 19:33:43

凌波丽

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【答案】应助回帖

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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, 牛~ 2012-05-22 08:23:18

我再告诉你一种更简单的和更直接研究蛋白质-蛋白质相互作用的试验方法，用Biocongation方法，即把用有关的交联剂把能够相互作用的蛋白质接到一起。相互作用必须要彼此靠的足够近，最是使用一种双功能交联剂把两种相互作用的蛋白质连接起来，可以在细胞外进行，如果有能够穿过膜的交联剂也可以在细胞中进行--------如果要在细胞中进行，那当然就省事多了，最好使用光激活试剂，在诱导你要研究的信号途径出现时，用特定波长的光照射（比如紫外光）已激活交联反应，这样相互作用的蛋白质就黏在一起了，之前最好给已知的与基因D相互作用的蛋白质加个Label，比如绿色荧光蛋白，这样就很容易知道谁与该蛋白质发生相互作用了，并很容易分离出来。如此可以循环下去，直至建立全部的特定细胞信号通路。
如果这样的试剂不好找，那么也可在细胞外进行。在诱导出现特定信号传导时，冷冻并且粉碎细胞，然后将细胞裂解液混入足够的一起提纯的已知的与基因D相互作用的蛋白质（简称为蛋白质X），事先给蛋白质X构建一种亲和标签（比如His6）用电磁搅拌器温和地在现特定信号传导时的温度下搅拌，而后加入一种支链氨基酸和EDC（碳二亚胺，催化羧基与氨基形成酰胺键），0-4度过夜电磁搅拌器温和搅拌，第二天走Ni亲和层析柱，由His6的蛋白质X就被揪出来，而与蛋白质X相互作用的蛋白质也有不少共价连接上了要与之相互作用的未知的在同一信号通路中的蛋白质也就一起就出来了。

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24楼2012-05-20 20:31:12

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西瓜: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-22 08:23:29

加氨基酸的目的是构成连接臂，实际上换成一种直链的二元羧酸或者直链二胺也可以，但是要考虑引起的酸碱环境对于蛋白质构象的影响。对于蛋白质的Label用GFP太麻烦，也可以只直接用透过膜的有机染料，比如双砷染料），事先要在目的蛋白质上构建出四个Cys，构成结合砷的配位键位点，这样才可保证透过膜的有机染料的作用位点的专一性。

25楼2012-05-20 20:42:14

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西瓜: 金币+1, “偷懒”很好啊 2012-05-22 08:23:54

顺便说一句：我是很懒的人，做实验总是想找到最是的方法，最不情愿高劳动力强度和高耗时的工作了；我的经验：如果一个实验不是现今条件下完全不可行的实验（比如不依靠外星人进行时光旅行或者不做外星飞碟而立刻去河外星系访问外星人等

），那么一般的讲，特别复杂的实验方案肯定会有简单可行而且可以发更高IF的论文的替代方案。

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jamy1989

26楼2012-05-20 20:47:02

jamy1989

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26楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-05-20 20:47:02:
顺便说一句：我是很懒的人，做实验总是想找到最是的方法，最不情愿高劳动力强度和高耗时的工作了；我的经验：如果一个实验不是现今条件下完全不可行的实验（比如不依靠外星人进行时光旅行或者不做外星飞碟而立刻去 ...

看来你的办事效率一定很高呀！你说的方法我会总结一下，用最合适的！多谢你的帮助呵！不懂的地方再来请教！

qwdr

27楼2012-05-21 09:58:21

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西瓜: 金币+3, 很热心哈 2012-05-22 08:24:16

补充一下：24楼的贴，钓出来与基因D直接作用的蛋白质（假定为蛋白质X）的相互作用的为止蛋白质（处于要研究的特定信号通路中，假定为蛋白质Y），蛋白质X与蛋白质Y因为直接相互作用在催化剂作用下呗中间臂连接在一起，因为蛋白质Y是未知的，所以分离出来蛋白质X与蛋白质Y的交联体后要用酯酶、酰胺酶或化学试剂将两者再切开，然后用质谱结合胰蛋白酶有限酶解蛋白质Y，再从数据库中搜索之并加以鉴定。
另外，这步也可以用分子印迹法。
再有研究DNA-Protein也可以用ChIP，这是一种共价交联方法，是DNA与Protein的共价交联。

28楼2012-05-21 21:08:15