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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA样品中的未除尽基因组DNA
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wanghuiyanyx

金虫 (著名写手)

[求助] RNA样品中的未除尽基因组DNA

用Qiagen小提试剂盒（包括柱子上DNaseI处理过程）提取细菌RNA用于芯片，电泳看不到基因组条带，但是以此样品作为模板进行PCR，却可以扩增出目的片段！这样的样品是否还需要再进行DNaseI处理？但是担心这样再处理一遍会导致样品被稀释，且RNA纯度受影响。请高手指教！

[ Last edited by wanghuiyanyx on 2012-2-28 at 22:08 ]
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1楼 2012-02-28 21:33:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

longrna

新虫 (正式写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助，补上！ 2012-03-08 18:34:35
担心降解可以把RNA沉淀下来再加上无水乙醇进行干冰运输。
其他RNA-seq也没要求必须除尽DNA吧？芯片就不清楚了
氯仿再抽提一次加上去掉的DNA在OD值上估计会损失40-50%。
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伟大航线....
4楼2012-02-29 10:50:35
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普通回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 还是很热心哦 2012-02-29 10:00:19
wanghuiyanyx(金币+20): ★★★很有帮助 2012-02-29 10:36:27
用于芯片估计对DNA污染要求很高吧？
个人经验：柱上消化效率不如在溶液体系里加DNase I消化。
既然你都提出来RNA了只能再进行DNaseI消化处理一次咯，当然，消化处理后用柱子或氯仿抽提一次即可不必担心纯度及浓度的问题（亦可去掉DNaseI）。不过你需要担心的是操作得非常谨慎注意，切勿到时把DNA消化干净了，RNA也跟着去了...
祝好！
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wanghuiyanyx
伟大航线....
2楼2012-02-29 09:16:13
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wanghuiyanyx

金虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by longrna at 2012-02-29 09:16:13:
用于芯片估计对DNA污染要求很高吧？
个人经验：柱上消化效率不如在溶液体系里加DNase I消化。
既然你都提出来RNA了只能再进行DNaseI消化处理一次咯，当然，消化处理后用柱子或氯仿抽提一次即可不必担心纯度及浓 ...

谢谢你的建议，我以前做qPCR的时候，提完RNA后用DNaseI处理后直接灭活的，但是用于芯片或RNA-SEQ的话，这样样品里会有杂志，担心影响下游反应及运输途中降解。想请教一下用氯仿再抽提一次会不会损失很多RNA啊？
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3楼2012-02-29 10:21:51
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wanghuiyanyx

金虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by longrna at 2012-02-29 10:50:35:
担心降解可以把RNA沉淀下来再加上无水乙醇进行干冰运输。
其他RNA-seq也没要求必须除尽DNA吧？芯片就不清楚了
氯仿再抽提一次加上去掉的DNA在OD值上估计会损失40-50%。

是的，RNA-seq仅根据OD和电泳图判断质量，但是残存的微量DNA会不会对基因表达水平分析有影响呢？亲爱的longrna ，请教一下有没有做过RNA-SEQ呢？
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5楼2012-02-29 12:15:54
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wanghuiyanyx(金币+20): ★★★很有帮助 2012-02-29 18:49:03
我做的RNA-SEQ是取total RNA，然后进行mRNA纯化（通过oligo（dT）的磁珠），所以测的其实是mRNA. 当然，由于受限于特异性，测出来的数据肯定会有核糖体RNA的存在，只占比较少的一定比例。
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伟大航线....
6楼2012-02-29 12:48:06
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wanghuiyanyx

金虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by longrna at 2012-02-29 12:48:06:
我做的RNA-SEQ是取total RNA，然后进行mRNA纯化（通过oligo（dT）的磁珠），所以测的其实是mRNA. 当然，由于受限于特异性，测出来的数据肯定会有核糖体RNA的存在，只占比较少的一定比例。

我也是打算这么做，就是担心所提的total RNA里残存痕量DNA会不会影响测序结果中基因表达变化倍数？
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7楼2012-02-29 18:48:55
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanghuiyanyx(金币+9): 2012-03-08 13:27:59
你要是做芯片或者做RNA-seq，不需要除gDNA的；qPCR需要除一下



PS，现在做deep-sequencing的同志们真多啊！
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致良知
8楼2012-03-08 13:03:30
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wanghuiyanyx

金虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by quiller2000 at 2012-03-08 13:03:30:
你要是做芯片或者做RNA-seq，不需要除gDNA的；qPCR需要除一下



PS，现在做deep-sequencing的同志们真多啊！

谢谢解释，这个问题我昨天也问过公司的技术支持。回复也是这样，在后续建库的时候会在进行mRNA富集和除DNA。做芯片也很费钱的，qRT-PCT通量小，大量做也是很贵，所以干脆就做测序了。
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9楼2012-03-08 13:53:38
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flying-fly

金虫 (正式写手)
顺道问下楼上的大侠们，我也要做RNA-seq，但是一些样品先提了RNA在-80度保存，没法一起提所有的RNA。那么我现在担心，前后一个多月的间隔，提好所有的RNA后，最早的会不会降解？Trizol提的。DEPC水溶解的。
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10楼2012-05-08 21:16:40
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