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Western若干问题
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我刚开始做Western，很多东西还不是很了解，目前内参还没有做出来。有一些问题想请教大家： 1 我的目的蛋白在40kD左右，12%的胶，电泳条件是：浓缩胶60V，分离胶100V。转膜的时候是恒压60V，胶上的Marker基本都转过去了。不知道这样的条件是否合适，有人说300mA转30-40分钟就差不多了。我的胶是0.75mm的，最佳的转膜条件应该是多少啊？ 2 我的上样量大概25微克左右，刚开始做的时候，是不是应该多点点样啊？ 3 一抗孵育的时候，因为实验室没有反转的一起，所有我就直接平放在4度冰箱里的，这样会有影响吗？ 4 我现在做的目的蛋白，市面上没有针对我所做的物种的特异性抗体，这样是不是就要订做抗体？订做抗体是不是需要该蛋白的编码序列，只有部分序列可以嘛？订做一个抗体大概要多少钱啊？ |
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5楼2012-03-12 19:28:23
2楼2012-02-23 12:30:27
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
倔强的投手(金币+2): ★★★很有帮助 2012-03-13 09:28:11
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1.因为没有看到你的结果，所以不确定是否需要改变条件，我们实验室做western也用0.75mm的胶，转膜条件是100V 1h，电流大概在每个槽子200-240mA，这和转膜buffer的浓度有关。 2.上样量根据你的结果而定吧，信号强弱和一抗，二抗浓度也有关系 3.最好不要这样，个人平放的孵育效果和摇床差很多。当然如果你一抗足够好用可能也能得出不错的结果。 4.很多抗体都是根据目标蛋白某一段序列设计的，当然为了提高抗体特异性，当然能提供的越完整越好。 |
3楼2012-03-04 20:16:29
4楼2012-03-04 20:17:32