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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 天然生物材料 » 提高DNA连接效率操作问题
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水墨丹青

木虫 (小有名气)

[求助] 提高DNA连接效率操作问题

之前做过ＤＮＡ的连接，用的是ＥＤＣ－ＮＨＳ体系，但是老是接不上去。所以想想各位请教请教~
我用的ＥＤＣ和ＮＨＳ的水溶液体系。体系的ＰＨ没有特意调，先加的ＥＤＣ，15min活化后加的ＮＨＳ，但是接完后计算连接效率才发现完全没有接上去，不知道各位能不能帮忙找找有什么问题。
如果有其他的高效率连接ＤＮＡ的连接方法，也还请大家多多指教。
以上~~
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1楼2012-02-22 11:34:33
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
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楼: Originally posted by hcswj at 2012-02-23 10:30:57:
你的DNA带什么基团？连接到什么基质上？

DNA上面接FAM啊~不过这个跟binding有什么关系呢？
接到类似于介孔硅的表面~~
你有什么建议不？
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5楼2012-02-25 00:36:40
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
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楼: Originally posted by hcswj at 2012-02-23 10:35:36:
还有你用的什么方法验证没有接上？

我的DNA上面是有FAM基团的，如果接上了或有荧光效应，但是我洗干净之后测荧光完全没有响应。。。
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6楼2012-02-25 00:37:35
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
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楼: Originally posted by hcswj at 2012-02-25 10:27:11:
你的介孔硅上面带羧基还是氨基？如果这个是你自己合成的，有没有表征过其表面基团？

带羧基。是我自己合成的，表征之后确定其表面基团就是-COOH。
但是现在的问题是我确定我的介孔硅上面是羧基，DNA上面是氨基，用EDC-NHS体系就是接不上去~发愁啊！
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8楼2012-02-26 09:06:34
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
呵呵、、欢迎围观~
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15楼2012-04-30 13:03:11
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by blairJing at 2012-03-20 16:52:24:
你是做分子信标吗？你那个介孔硅表面有可能空间位阻大吧，是FAM在介孔硅上还是DNA在介孔硅上啊，我也做分子信标，讨论一下啊

不是，我是做的aptamer，跟分子信标差不多啦~不过我现在aptamer接上去了，你的如何呢？
不过空间位阻应该不存在吧？我的表面除了修饰羧基基团没有别的啊，如果是因为羧基太多那应该更容易接上去不是。
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16楼2012-04-30 13:06:59
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水墨丹青

木虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by duruo at 2012-03-24 13:55:45:
建议你在微酸环境下用EDC/NHS活化羧基
然后在微碱条件下，用氨基取代

亲，我现在接上去了，直接pH=5.0，活化完了还是5.0buffer里面过夜，就接上去了
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17楼2012-04-30 13:07:56
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