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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求问紫外分光光度法测RNA浓度和纯度
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humourhy

新虫 (小有名气)

[求助] 求问紫外分光光度法测RNA浓度和纯度

我的研究方向是做生物材料的，之前对生物学了解很少，不过现在的进度需要涉及一点RT-qPCR的实验，希望大家能够解答我的一点困惑

请问提取出来的RNA，用20uL溶解。如果利用紫外分光光度计测量，用常规的比色皿，需要装3ml的溶液，稀释太多倍了，吸光度很低很难检测。后来委托朋友利用Nanodrop2000检测了下，只需要吸1uL，结果不错，A260/A280=1.94。由于今后开展此方面工作不可能总麻烦朋友，而且这个仪器还挺贵的。所以想请问下大家都是怎么做的呀？

后来我自己查了下，貌似有利用微量比色皿在分光光度计上做的。不知如果采用这个方法，那建议测试稀释多少倍数，且对应吸光度在什么范围比较好呢？
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1楼 2011-11-21 22:25:07
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！很有经验啊！一般比色皿都说要三分之二体积以上，楼主还需具体参考所用的仪器说明书。 2011-11-23 21:00:13
我见过有以下几种装备
1ul 能测浓度准确方便，能用这种方法是最好的。
100ul 比起1ul的稍微麻烦，一般要稀释20倍。
700ul 体积的增大越来越不准确，最多稀释30倍。
1ml 最多稀释30倍
关于700以上的比色皿个人认为液体要放到总体积的三分之二。
当然要看你们分光器的光路能穿越的位置。要是能穿越比色杯的三分之一那就加三分之一就可以。切忌不能人为提起比色杯让光路穿透。误差巨大。
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humourhy
10楼2011-11-23 12:37:53
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-11-23 20:56:48
我们也是用NanoDrop，这个好用，1ul即可以测的。那种比色杯的方法是旧的，比较老的方法了，麻烦....
如果你朋友不远，你还是麻烦一下他吧。有NanoDrop的话整个测的操作其实很简单，估计不用1分钟测一个，就是点上1ul 样品然后按一下鼠标即有浓度、260/280等数据出来。
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伟大航线....
2楼2011-11-21 23:27:51
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humourhy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2011-11-22 10:21:06:
我和楼主一样 测浓度要麻烦朋友 不过是女朋友 在楼下实验室

哈哈，这多方便啊~顺便还把感情升华了，hoho~
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7楼2011-11-22 10:31:28
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
humourhy(金币+5): 谢谢您的耐心解答 2011-11-22 10:17:47
西瓜(金币+2): Good！ 2011-11-23 20:57:19
这个我们这边测的还挺多的，每次就是洗2 uL样品稀释50倍，总共100 uL加入微量比色皿的底部槽里就行了，测出来的数据还是比较准确的。OD260/OD280值介于1.7-2.0之间表明纯度比较高。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
3楼2011-11-22 09:37:30
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humourhy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gjs713 at 2011-11-22 09:37:30:
这个我们这边测的还挺多的，每次就是洗2 uL样品稀释50倍，总共100 uL加入微量比色皿的底部槽里就行了，测出来的数据还是比较准确的。OD260/OD280值介于1.7-2.0之间表明纯度比较高。

您好，请问下你用的微量比色皿是多少体积的呢？
我这里有的700uL的比色皿，貌似装100uL液面不够高~是不是需要更小的比色皿才合适呀？
听我的师姐说，我们实验室的国产光度计的光源狭缝较宽，对更小体积的比色皿貌似有问题，不知您使用的紫外光度计是什么牌子的呀，进口的还是国产的呢？
非常感谢您的解答~
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4楼2011-11-22 10:14:01
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humourhy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-21 23:27:51:
我们也是用NanoDrop，这个好用，1ul即可以测的。那种比色杯的方法是旧的，比较老的方法了，麻烦....
如果你朋友不远，你还是麻烦一下他吧。有NanoDrop的话整个测的操作其实很简单，估计不用1分钟测一个，就是点上 ...

呵呵~不失为一个好方法，就是要经常麻烦朋友了
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5楼2011-11-22 10:17:14
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
西瓜: 炫耀贴，鉴定完毕^_^ 2011-11-23 20:57:45
我和楼主一样 测浓度要麻烦朋友 不过是女朋友 在楼下实验室
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6楼2011-11-22 10:21:06
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by humourhy at 2011-11-22 10:14:01:
您好，请问下你用的微量比色皿是多少体积的呢？
我这里有的700uL的比色皿，貌似装100uL液面不够高~是不是需要更小的比色皿才合适呀？
听我的师姐说，我们实验室的国产光度计的光源狭缝较宽，对更小体积的比色皿 ...

比色皿容积是700uL，但是它的底部槽却很小，也就能装100uL样品，测定时只需要把底部槽加满就可以测定了，并不影响数据。
我们的仪器是Eppendorf产的。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
8楼2011-11-23 09:00:46
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humourhy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gjs713 at 2011-11-23 09:00:46:
比色皿容积是700uL，但是它的底部槽却很小，也就能装100uL样品，测定时只需要把底部槽加满就可以测定了，并不影响数据。
我们的仪器是Eppendorf产的。

谢谢你
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9楼2011-11-23 09:13:59
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