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求高手解救荧光定量的问题
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最近最荧光定量试验，一直很不顺，用的是bioer的试剂，IQ5的机器。做的是miRNA的相对定量表达，用的是∆∆CT法，所扩增的片段有点大，但在200bp之内，出现很奇怪的现象，附上图： 扩增曲线： 溶解曲线： 很是疑惑为什么前面的曲线不平，应该不是机器的问题，因为其他人做没有出现这样的现象，我把浓度给变大10倍也没有很好的改观，求高手指教，非常感谢！  扩增曲线  溶解曲线  溶解曲线的倒数图 |
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4楼2011-11-24 00:20:34
西瓜
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【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-11-06 08:16:04
小橘子~(金币+1): 非常感谢你认真的分析和建议 2011-11-06 10:04:03
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-11-06 08:16:04
小橘子~(金币+1): 非常感谢你认真的分析和建议 2011-11-06 10:04:03
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你说的“前面的曲线不平”是什么意思？ 从你的扩增曲线来看，是模板浓度太低了。按照2的N次方扩增，模板浓度大10被，Ct值只变小3，10倍还是不够的。一般情况下，15~20个循环左右扩增曲线起来比较合适。 你的部分样品35个循环后才有扩增，有点夸张……因为一般认为，阴性对照35个循环之前没有扩增是正常的…… 虽然这样子也能定量，但是这么多循环才有扩增，有可能是非特异的扩增了，还是想办法加大模板浓度吧。反转录的时候多加些RNA，可以取试剂盒推荐的RNA用量的上限。 从融解曲线来看，扩增还是比较特异的。你的特异的峰有高有低，是因为PCR产物还没达到饱和（从扩展曲线看，离平台期还远呢）。 综上，主要的问题，还是模板浓度过低。好在，扩增的特异性不错。  |
2楼2011-11-06 00:02:40
3楼2011-11-23 10:40:04
shaquila
金虫 (正式写手)
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5楼2011-11-24 11:37:57
