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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR一直扩不出目的条带
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直扩不出目的条带

各位大虾你们好：我想问一下我最近跑pcr一直扩不出我的目的条带，我退后温度从49度到60度都跑过还是没结果，我的引物合成单上的这对引物其中一条引物的Tm值是52.74，一条Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循环35个，72度10min，4度保存。我的体系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的体系。我的模板是提取的重组质粒！各位高手给小妹指点一下吧！谢谢了！
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1楼 2011-10-28 20:15:17
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的泳道里有弥散吗？质粒稀释多少倍？
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jiayoubashaonian
2楼2011-10-28 22:29:33
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
有弥散，隐约能看到拖带现象，另外在700bp还有条带，但是我的条带大小是300bp多，质粒的浓度不没测过！但是提完质粒检测条带可亮！
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3楼2011-10-29 15:33:16
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孙梦婧

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

touch-dowm pcr试一下
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努力向前看
4楼2011-10-29 17:56:13
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

质粒模板稀释100--1000倍后加1--5ul做模板，我这几次也这样，模板稀释后就扩出来了。另外检查下你的PCR试剂有没有问题
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
5楼2011-10-29 19:40:45
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流金岁月

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议你做20ul体系试一下。
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6楼2011-10-29 20:07:55
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人感觉不是体系的原因，我曾经遇到过N次这种情况，一次是因为两端引物浓度不一样造成的（看引物合成单上的OD值），一次是因为引物设计上有问题。楼主这个很明显退火温度已经不能再降了，已经出现非特异性扩增了；另外，你的buffer中加过MgCL2了吗？还有就是你的两端引物是不是太短了啊？加上保护碱基和酶切位点，Tm值才五十多？最后一个不明白的地方是，你的Taq酶加的好多啊（不过应该不会影响效果）！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
7楼2011-10-29 20:19:32
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江苏虞游

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以尝试做一次20或25ul体系的，我一般都是做的25ul体系的
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8楼2011-10-30 09:13:01
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zhfge

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先说个体外话：建议你换一个程序哦
你的变性、退火、延伸时间都太长了（300bp的片段延伸就算是高保真酶也只要10s就够了），你的程序太浪费时间了。
1、在做其他的尝试前，建议你先确认你的体系中各成分是否有被污染、有没有失效。
2、如果模板浓度非常高，降低点浓度试试；
3、两条引物的退火温度差异不大，不需要做TouchDown；但是建议你检查一下你的引物匹配程度，有无可能错配；要是都没问题，向引物合成公司投诉，要求重合。（有的时候出现双带甚至多带并不是因为你的引物设计有问题，而是合成公司做纯化、或者分装时压根就把引物给污染）。
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9楼2011-10-30 18:24:52
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zhfge

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by imyting at 2011-10-29 20:19:32:
个人感觉不是体系的原因，我曾经遇到过N次这种情况，一次是因为两端引物浓度不一样造成的（看引物合成单上的OD值），一次是因为引物设计上有问题。楼主这个很明显退火温度已经不能再降了，已经出现非特异性扩增了 ...

50ul体系加1ul 酶倒不算太多；具体还要看看酶活或者使用时间。有的时候酶放的太久或者保存不当导致酶活下降，多加点倒也没什么的。
但是要是很高，酶加多了真的会导致非特异性扩增哦~~~这个是我亲身经历的~~~
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10楼2011-10-30 18:29:23
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