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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直扩不出目的条带

各位大虾你们好:我想问一下我最近跑pcr一直扩不出我的目的条带,我退后温度从49度到60度都跑过还是没结果,我的引物合成单上的这对引物其中一条引物的Tm值是52.74,一条Tm值是55.02,我跑pcr的程序是95度2min,94度40s,55度40s,72度40s,循环35个,72度10min,4度保存。我的体系是模板2ul,dntp1ul,引物各1ul,buffer5ul,Taq酶1ul,DDW39ul,共50ul的体系。我的模板是提取的重组质粒!各位高手给小妹指点一下吧!谢谢了!
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zhfge

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先说个体外话:建议你换一个程序哦
你的变性、退火、延伸时间都太长了(300bp的片段延伸就算是高保真酶也只要10s就够了),你的程序太浪费时间了。
1、在做其他的尝试前,建议你先确认你的体系中各成分是否有被污染、有没有失效。
2、如果模板浓度非常高,降低点浓度试试;
3、两条引物的退火温度差异不大,不需要做TouchDown;但是建议你检查一下你的引物匹配程度,有无可能错配;要是都没问题,向引物合成公司投诉,要求重合。(有的时候出现双带甚至多带并不是因为你的引物设计有问题,而是合成公司做纯化、或者分装时压根就把引物给污染)。
9楼2011-10-30 18:24:52
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的泳道里有弥散吗?质粒稀释多少倍?
jiayoubashaonian
2楼2011-10-28 22:29:33
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

有弥散,隐约能看到拖带现象,另外在700bp还有条带,但是我的条带大小是300bp多,质粒的浓度不没测过!但是提完质粒检测条带可亮!
3楼2011-10-29 15:33:16
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孙梦婧

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

touch-dowm pcr试一下
努力向前看
4楼2011-10-29 17:56:13
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