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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

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[求助] PCR一直扩不出目的条带

各位大虾你们好：我想问一下我最近跑pcr一直扩不出我的目的条带，我退后温度从49度到60度都跑过还是没结果，我的引物合成单上的这对引物其中一条引物的Tm值是52.74，一条Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循环35个，72度10min，4度保存。我的体系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的体系。我的模板是提取的重组质粒！各位高手给小妹指点一下吧！谢谢了！

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1楼 2011-10-28 20:15:17

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zhfge

铜虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

首先说个体外话：建议你换一个程序哦
你的变性、退火、延伸时间都太长了（300bp的片段延伸就算是高保真酶也只要10s就够了），你的程序太浪费时间了。
1、在做其他的尝试前，建议你先确认你的体系中各成分是否有被污染、有没有失效。
2、如果模板浓度非常高，降低点浓度试试；
3、两条引物的退火温度差异不大，不需要做TouchDown；但是建议你检查一下你的引物匹配程度，有无可能错配；要是都没问题，向引物合成公司投诉，要求重合。（有的时候出现双带甚至多带并不是因为你的引物设计有问题，而是合成公司做纯化、或者分装时压根就把引物给污染）。