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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

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专业: 兽医传染病学

[求助] PCR一直扩不出目的条带

各位大虾你们好：我想问一下我最近跑pcr一直扩不出我的目的条带，我退后温度从49度到60度都跑过还是没结果，我的引物合成单上的这对引物其中一条引物的Tm值是52.74，一条Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循环35个，72度10min，4度保存。我的体系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的体系。我的模板是提取的重组质粒！各位高手给小妹指点一下吧！谢谢了！

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1楼 2011-10-28 20:15:17

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imyting

至尊木虫 (正式写手)

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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

个人感觉不是体系的原因，我曾经遇到过N次这种情况，一次是因为两端引物浓度不一样造成的（看引物合成单上的OD值），一次是因为引物设计上有问题。楼主这个很明显退火温度已经不能再降了，已经出现非特异性扩增了；另外，你的buffer中加过MgCL2了吗？还有就是你的两端引物是不是太短了啊？加上保护碱基和酶切位点，Tm值才五十多？最后一个不明白的地方是，你的Taq酶加的好多啊（不过应该不会影响效果）！