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TCA/丙酮法提取植物蛋白 已有6人参与
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我用TCA/丙酮法提取植物蛋白，得到的蛋白在缓冲液中溶解性很差，呈胶质状，请问高手，这样的现象正常吗？ 另外更糟糕的是提到的蛋白做SDS-PAGE跑不出条带，想请教问题出在哪里？针对我的实验材料，TCA/丙酮法可行吗？ |
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qiugaoxiang
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2楼2011-10-28 10:44:10
wangjetby
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3楼2011-10-28 11:25:08
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jhu132llh(金币+2): 鼓励交流 2011-10-28 17:08:59
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提取步骤参照文献 biotechnol.&biotechnol.EQ.24/2010/4 10g叶片，液氮磨成细粉，加20ml预冷的10%TCA-丙酮，充分混匀，-20℃放90min,4℃、11000rpm(约12000g)离心15min, 弃上清。 沉淀用20ml冷丙酮洗2次。 将沉淀在室温空气中晾干。 晾干后的沉淀加 6ml TLB缓冲液（8M Urea, 2M thiourea, 4%(w/v)CHAP, 0.4%(v/v)carrier ampho, 50mM DTT），充分混匀后保持5min. 提取物离心(11000rpm,15min,4℃),取上清液。 上清液加入4倍含10%（v/v)TCA的冷丙酮（其中含20mMDTT），在-20℃保持90min，混合物离心(11000rpm,15min,4℃),取沉淀。 沉淀用含20mMDTT的冷丙酮洗涤2次，沉淀风干后加TLB缓冲液溶解，得蛋白。 ----------------------------------------------------------------------------------- 得到的蛋白在TLB缓冲液中溶解性很差，SDS-PAGE也跑不出条带。 ---------------------------------------------------------------- 文献中的离心条件是16000g, 但我的离心机只能达到12000g。是不是离心力不够呢？ -------------------------------------------------- 多谢高手指点！ |
4楼2011-10-28 12:38:00
guxinhan123
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6楼2011-10-28 17:03:59
changer32
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7楼2011-10-28 21:51:07
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
jhu132llh(金币+3, APEPI+1): good,感谢积极应助,很专业 2011-10-30 18:15:46
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jhu132llh(金币+3, APEPI+1): good,感谢积极应助,很专业 2011-10-30 18:15:46
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看看这个nature protocol Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues 我前几个星期，刚用这个protocol作的，还可以，你是要做2-D 吧。 主要是丙酮挥干这一步，不要太干，太干很难。 用超声可能能帮助溶解 步骤是这样的，和你的差不多，但少几步： （1）Place frozen plant tissue into the cold mortar. Add acid-washed sand (0.5–5 g per 1 g fresh tissue; optional) and PVPP (1–15% (wt/wt); optional) and grind tissue into a fine powder using the pestle and mortar （2）Suspend the powder in TCA extraction buffer (5-15 ml solution per gram tissue). Store at –20 1C overnight. Proteins should precipitate as white flakes （3）Centrifuge the sample for 30 min at 5,000g at 4 1C. Carefully pipette out the supernatant and discard. （4）Add 10 ml ice-cold acetone to the pellet and centrifuge the sample for 10 min at 5,000g at 4 1C. Carefully remove the supernatant with a pipette and discard. （5）Repeat Step （4）two more times （6）Resuspend the pellet in a buffer for protein resuspension that is appropriate for the downstream analytical approach. Notes： Protein resolubilization is often one of the most challenging steps of the procedure. It may be necessary to increase the amount of buffer added to resuspend the pellet fully, and in some cases there may always be a residual pellet. Pellets can be resuspended in a microcentrifuge tube with a mini-magnetic stirrer. Sonication can also be used to help resuspend the pellet, but care should be taken not to heat the sample, so it is recommended that the sample be sonicated in short bursts while dipping the tube in ice water. |
8楼2011-10-30 00:15:04
changer32
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