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关于重组质粒遗传转化中载体的问题
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请教各位：用于对质粒双酶切的载体怎么选择？ 最近做关于大豆一些特异表达基因筛选鉴定的实验，是利用cDNA-AFLP方法找到所需的DNA条带，再与**载体连接，并进行重组质粒遗传转化和阳性克隆鉴定。 其中这个**载体我不知道怎么选择？ 是根据所需要的酶切位点来选择吗？如果是的话，那这个酶切位点又该如何选择呢？ 刚开始接触这一方面，不懂得太多，还望大家详细告解，谢谢。 “参照常规方法，用 5μl 连接产物热激转化大肠杆菌感受态 DH5α，铺含有 50μg/mL氨苄青霉素的 LB 平板，37℃下培养后挑取单菌落。用含有 50μg/mL 氨苄青霉素的LB 液体培养基培养单菌落，碱裂解法提取质粒。进一步用 pUCm-T 载体上含有的多克隆限制性切点 EcoRI 和 HindIII 对质粒进行双酶切，鉴定阳性克隆。酶切反应 37℃下进行，时间为 2 h。酶切的反应体系如下表。同时，以质粒为模板，用选择性扩增的特异引物对进行 PCR 的进一步检测。”这是我找到的一篇做法相似的文献内容，我所不明白的就是里面那个pUCm-T载体他是如何选择的。 |
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2楼2011-10-27 18:36:53
【答案】应助回帖
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wfw014(金币+3): 十分感谢，受教了 2011-10-27 23:04:20
jhu132llh(金币+3): good,鼓励积极应助 2011-10-28 08:35:57
wfw014(金币+3): 十分感谢，受教了 2011-10-27 23:04:20
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看样子你需要2个载体，第一个是克隆载体，第二个是转化载体。 克隆载体比较好选，商品化的很多，像PMD-18T，pGEM-T easy载体，基本都可以，用于克隆测序，确定这个基因的序列与你想要一致。 酶切位点要选择具有你的基因片段里没有的，酶的酶切效率要尽量选择高一些的，酶切后最好是粘末端。 转化载体的选择要和酶切位点的选择结合起来，可以向你自己的导师或师兄师姐请教。 |
3楼2011-10-27 21:49:58
