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笔冰河

银虫 (小有名气)

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[求助] 测序结果怪异

从基因组中扩增出一片段，回收连接T载体，转化菌株，单克隆摇菌拿去测序，测序成功，得到单一的测序结果；随后从T载体上扩增目的片段，结果跑胶却得到多条位置非常接近的片段（相差几十bp），因为目的基因有多个同源性很高的基因（长度相差几十bp，在5‘和3’同源性都高达99%），所以同一引物扩增出多个相近片段是可能性很大的，但为什么第一次pcr后跑胶只有一条带，而且测序也只测到一条DNA呢？麻烦高手解答，谢谢！

第一次菌落PCR结果

第二次从T载体上扩增目的片段

第一次从基因组上扩增目的片段

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1楼 2011-10-22 15:42:50

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笔冰河

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by heroyl at 2011-10-23 14:12:52:
在克隆的菌液或是在提取的质粒当中扩的时候扩增效率高，因此引物和其它的非目的条带可以结合，因此有杂带的。

我开始也以为是杂带，后来测序发现，是和目的片段同源的基因组上另一片段（由于我需要的目的片段是gene family的其中一条，这里面的序列在编码区的5端和3端同源性非常高，所以设计一对引物，很可能扩出很多条带，相差只是几十bp）

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9楼2011-10-23 15:36:35

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zc10052157

新虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-22 21:13:36
笔冰河(金币+1): 杂带的模板是什么呢？ 2011-11-01 09:58:15

你是说从基因组里P出了单一条带测序也正确那出现杂带应该是后面验证出的问题了单克隆应该是对的

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hold住

2楼2011-10-22 20:51:11

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csh973

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 嗯，应该早点试试重新跑胶 2011-11-01 09:54:45

提高胶的浓度，检测一下第一次PCR的产物试试看是否存在两条或多条近似带

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3楼2011-10-23 08:26:04

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madengyu

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

4楼2011-10-23 08:37:30

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