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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果怪异
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 测序结果怪异

从基因组中扩增出一片段，回收连接T载体，转化菌株，单克隆摇菌拿去测序，测序成功，得到单一的测序结果；随后从T载体上扩增目的片段，结果跑胶却得到多条位置非常接近的片段（相差几十bp），因为目的基因有多个同源性很高的基因（长度相差几十bp，在5‘和3’同源性都高达99%），所以同一引物扩增出多个相近片段是可能性很大的，但为什么第一次pcr后跑胶只有一条带，而且测序也只测到一条DNA呢？麻烦高手解答，谢谢！

第一次菌落PCR结果



第二次从T载体上扩增目的片段



第一次从基因组上扩增目的片段
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1楼 2011-10-22 15:42:50
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-22 21:13:36
笔冰河(金币+1): 杂带的模板是什么呢？ 2011-11-01 09:58:15
你是说从基因组里P出了单一条带  测序也正确  那出现杂带应该是后面验证出的问题了    单克隆应该是对的
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hold住
2楼2011-10-22 20:51:11
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csh973

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 嗯，应该早点试试重新跑胶 2011-11-01 09:54:45
提高胶的浓度，检测一下第一次PCR的产物试试看是否存在两条或多条近似带
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3楼2011-10-23 08:26:04
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madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2011-10-23 08:37:30
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heroyl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 谢谢 2011-11-01 09:56:14
在克隆的菌液或是在提取的质粒当中扩的时候扩增效率高，因此引物和其它的非目的条带可以结合，因此有杂带的。
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
5楼2011-10-23 14:12:52
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笔冰河

银虫 (小有名气)
如图4，为图二中切胶回收连接T载体，转化后，菌落pcr后的跑胶结果，出现多个长度的条带，其中一条带测序后发现和第一次单挑带测序结果不同，是同源的两种基因，也就不是杂带，应该是第一次从基因组上一起扩增出来的，但是为什么第一次测序却只测到一条基因？

图四
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6楼2011-10-23 15:27:44
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by madengyu at 2011-10-23 08:37:30:
从第二个电泳图看，你的Marker好像也是有阴影吧，应该是跑电泳的事吧，是不是电压有点大呢。我一般用120V跑效果挺好。

确实是有多条带位置紧密，它们为同一基因进化而来，是基因组中共同存在的同源序列。我用的是100v，一直没问题
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7楼2011-10-23 15:30:29
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-10-22 20:51:11:
你是说从基因组里P出了单一条带  测序也正确  那出现杂带应该是后面验证出的问题了    单克隆应该是对的

后面验证出了问题？不懂，麻烦详解
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8楼2011-10-23 15:32:25
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by heroyl at 2011-10-23 14:12:52:
在克隆的菌液或是在提取的质粒当中扩的时候扩增效率高，因此引物和其它的非目的条带可以结合，因此有杂带的。

我开始也以为是杂带，后来测序发现，是和目的片段同源的基因组上另一片段（由于我需要的目的片段是gene family的其中一条，这里面的序列在编码区的5端和3端同源性非常高，所以设计一对引物，很可能扩出很多条带，相差只是几十bp）
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9楼2011-10-23 15:36:35
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wxq999

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜:编辑内容 2011-10-24 17:29
西瓜(金币-10): 2011-10-24 17:30:10
-------------广告内容--------------------

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-24 at 17:29 ]
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10楼2011-10-24 17:09:24
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