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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 测序结果怪异

从基因组中扩增出一片段,回收连接T载体,转化菌株,单克隆摇菌拿去测序,测序成功,得到单一的测序结果;随后从T载体上扩增目的片段,结果跑胶却得到多条位置非常接近的片段(相差几十bp),因为目的基因有多个同源性很高的基因(长度相差几十bp,在5‘和3’同源性都高达99%),所以同一引物扩增出多个相近片段是可能性很大的,但为什么第一次pcr后跑胶只有一条带,而且测序也只测到一条DNA呢?麻烦高手解答,谢谢!

第一次菌落PCR结果



第二次从T载体上扩增目的片段



第一次从基因组上扩增目的片段
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heroyl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 谢谢 2011-11-01 09:56:14
在克隆的菌液或是在提取的质粒当中扩的时候扩增效率高,因此引物和其它的非目的条带可以结合,因此有杂带的。
实验虐我千百遍,我待实验如初恋
5楼2011-10-23 14:12:52
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


wanhscn(金币+1): 鼓励应助! 2011-10-22 21:13:36
笔冰河(金币+1): 杂带的模板是什么呢? 2011-11-01 09:58:15
你是说从基因组里P出了单一条带  测序也正确  那出现杂带应该是后面验证出的问题了    单克隆应该是对的
hold住
2楼2011-10-22 20:51:11
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csh973

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 嗯,应该早点试试重新跑胶 2011-11-01 09:54:45
提高胶的浓度,检测一下第一次PCR的产物试试看是否存在两条或多条近似带
3楼2011-10-23 08:26:04
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madengyu

禁虫 (小有名气)

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4楼2011-10-23 08:37:30
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