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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母转化
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tingl0087

金虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母转化

各位做毕赤酵母转化的大虾们~~
我现在做毕赤酵母转化想表达一个同源的基因，3.4天后长出来很小很小的白色菌落，但是这些菌落一直维持大小不变，再继续培养or划线or接到液体培养基中培养都不长，什么原因啊？还有，这些菌挑起来感觉硬硬的，一颗一颗的。。。
制备感受态时分别用invitrogen手册上的方法和网上下的方法（见下文）做好几次了，用的载体是piczA，电转1.5kV，用的是伯乐的电转仪，显示电击时间都在5.5-5.8ms之间，30°复苏2h，涂布新配的YPDS+zeocin平板。
感受态制备方法高效版（网上下的）：
取1ml过夜培养的细胞（od6-10），4℃10000g离心1min，弃上清，1ml无菌水洗一次，同样条件离心，弃上清，用1ml处理液重悬，室温静置20min（处理液：10mMLiCl，10mMDTT，0.6M山梨醇，10mMTrisHCl），同样条件离心，弃上清，加入1ml1M山梨醇，洗涤3次，到最终体积为80ul，加入10ul处理好的质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min，电击，立即加入1ml冰冷的山梨醇。
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1楼 2011-10-20 11:21:05
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肉丸001

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by tingl0087 at 2011-10-20 11:21:05:
各位做毕赤酵母转化的大虾们~~
我现在做毕赤酵母转化想表达一个同源的基因，3.4天后长出来很小很小的白色菌落，但是这些菌落一直维持大小不变，再继续培养or划线or接到液体培养基中培养都不长，什么原因啊？ ...

你摇多久啊？ 长得很慢的吧。。。
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2楼2011-10-23 11:23:29
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mhmtf

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+10): 处女帖，鼓励发帖交流，做PCR检测了吗 2011-10-25 18:15:06
tingl0087(金币+2): 终于碰上同道中人了，交流交流。。。 2011-10-26 09:56:44
,我最近做的也是，转化完涂板长了两天，也是长出小小的白色菌落，看着像酵母又不像酵母，不同的是我的板上还长了大的白色菌落，搞不懂是染菌了还是怎么回事~~·
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gdfh
3楼2011-10-25 17:14:24
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tingl0087

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mhmtf at 2011-10-25 17:14:24:
,我最近做的也是，转化完涂板长了两天，也是长出小小的白色菌落，看着像酵母又不像酵母，不同的是我的板上还长了大的白色菌落，搞不懂是染菌了还是怎么回事~~·

大的白色的菌落应该是吧，挑了养了提下基因组啦~我的就没有。。。
我用Takara的Lysis buffer for microorganism to direct PCR 这个裂解液处理菌落直接做PCR，扩出来很奇怪的条带，在紫外下看是偏黄色，弯弯的，大小也不对，连2.2kb的都没有。。。不知道是什么原因。
另外，这些白色的小菌落，我接到带抗生素的液体培养基中也长。。。
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4楼2011-10-26 09:56:05
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sususimple

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流，祝顺利！ 2011-11-04 16:21:46
tingl0087(金币+4): 谢谢~几天不见有人应助，我还以为帖子沉了。。。你用5ml制感受态时，方法跟invitrogen的一样吗？只是按比例缩小？ 2011-11-07 15:43:43
白色菌落 不长大 应该不是酵母
我以前做的时候 和你用的载体一样 3-4天基本就可以准备挑菌做鉴定和表达了
另：我制备感受态细胞的时候，都是用5ml的菌制备1个感受态细胞的。转化效率还可以，一般用10微克DNA转化，有至少100颗单菌落。
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5楼2011-11-04 13:26:14
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

tingl0087(金币+4): 一个国外的师姐带我转出来了，还是谢谢~ 2011-11-23 09:10:56
酵母电转生长的OD很关键啊，OD大概在0.8-1.3之间，太低菌少；太高转化率太低。1500g离心10min，去离子水洗两遍,1M山梨醇洗两遍，然后重悬电转。线性化的质粒质量要高。
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6楼2011-11-14 17:29:35
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