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luolh2004

金虫 (著名写手)

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[交流] MTT法检测hegf生长因子活性系列问题求助

最近实验一直在做MTT实验，注意不是毒理性实验，是检测药物（hegf人表皮生长因子）活性实验，hegf可促进成纤维细胞的生长，通过MTT测定检测其促细胞生长的能力，即hegf的活性。我的实验设计和基本方法如下：
1.使用细胞为：Balb/c3T3小鼠成纤维细胞
2.培养基为DMEM和FBS  ，但药典方法使用的是R1640和CS，这两个组合我都进行过实验，结果都是不理想。
3.实验设计如下：
类别       种板细胞数设置复孔数/个浓度梯度（4倍稀释）/个
hegf标准品 5000个/孔       3                                  8
hegf样品       5000个/孔       3                            8
阳性对照       5000个/孔       3                            无
阴性对照       5000个/孔       3                            无
空白对照             无          6                                  无
注：维持培养基为加入0.4%的血清，完全培养基是加入10%的血清。
   5.培养时间和条件都与药典方法一致。

经过一段时间的摸索，现有如下问题，有经验的朋友一定要多指教，谢谢！
   1.阴性对照组的结果比标准品组和样品组的结果要好，但比阳性对照差。（理想的结果是阳性对照组是最好，标准品组和样品组次之，阴性对照组是最差。）
   2.实验数据的平行性非常差，在加入MTT孵育4h后，在显微镜下观察，发现复孔的平行性非常差（MTT只对活细胞有作用，与琥珀酸脱氢酶反应后产生紫色结晶，所以在显微镜下观察，可以明显看到结晶的量多少），个别孔的紫色结晶量非常少，有些孔又很多。这个问题是不是跟细胞的状态有关，在培养过程中，细胞生长和死亡率不一致，导致平行性非常差。
   3.酶标仪波长和震荡时间的问题：药典使用的波长是以630nm为参考波长，570nm为检测波长，由于实验室没有条件，我们使用的是490nm的波长检测，在网上看了相关资料，有些朋友说490nm的波长也可以使用，灵敏度也不错，不知道是否可行。
   现在我们实验在酶标仪的震荡时间设置为30秒  强震荡。震荡的目的是为了使紫色结晶溶解更充分，能不能设置震荡时间越长越好呢？时间过长也会影响实验数据么？目前我们设定的时间和震荡强度是不是合理的呢，有经验的朋友给些建议吧。
      4.培养基PH值的问题：我们使用R1640干粉培养基配制，配制过程按照说明书进行，调节PH值7.0，过滤后PH值为7.48或者7.47，而细胞培养基的PH值为7.2-7.4，略高的PH值对细胞影响大不大？如果重新调整PH值后，再进行过滤，配制的R1640还能继续使用吗？DMEM培养基我们是直接购买GIBCO的，不需要配制，但在使用一段时间后发现其PH值升到8以上，这样的培养基还能继续使用么？
   有些朋友说，可以通入无菌的二氧化碳气体调节PH值，但是我们实验室没有这样的条件，是否可以使用1N的HCL调节，然后过滤？还有些朋友说可以拧松盖子放到通有二氧化碳的培养箱内放置一段时间，PH就会下降，这样的操作可行吗？
   有什么方法可以很好的保存培养基，维持PH值恒定？
   注：我们的培养基都是放在4度冰箱保存。
   5.DMSO的问题：看到资料说进行细胞冻存，一段要使用特定的DMSO,如Sigma D2650)  ，我们使用的是sigma的DMSO，但是型号好像不是这个，不知道行不行？MTT实验使用的DMSO也是sigma的，有些人可能是使用国产的吧。

暂时想到这么多问题，后续有问题再补充吧。

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1楼2011-09-23 10:58:58

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liyangmiscap

木虫 (著名写手)

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luolh2004(金币+15): 谢谢回帖，给你追加了15个BB 2011-10-10 13:35:42

EGF活性的测定，个人认为铺板是比较关键的，当然前提是保证细胞状态良好。细胞的消化时间，细胞计数，吹打是否均匀，孔中细胞是否分布均匀都是影响因素
培养基的pH问题，根据1640的配制说明，是要加入NaHCO3的（记得好像是每升加入3.0g），配制用水我们用的是超纯水，用0.1mol/ml的盐酸（灭菌处理）调节pH，过滤除菌，配制完成后放在4℃冰箱里保存。楼主不在二氧化碳培养箱里培养细胞吗？
细胞冻存一般会选择sigma细胞级的DMSO，检测时用国产普通的DMSO是没什么问题的

[ Last edited by liyangmiscap on 2011-10-10 at 10:41 ]