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donnafeng

金虫 (小有名气)

[求助] 怎么提高诱导表达的目的蛋白含量

BL21诱导表达的蛋白含量不高（ OD0.6~0.8时添加IPTG 浓度0.1mM 28度诱导6h） 请教提高表达的方法
1 IPTG到底什么时候添加 有人说能摇到的最高OD值（大约2.0）一半时添加（即1.0） 有的说0.5的时候添加 到底应该选择什么时候添加 为什么
2 诱导表达时通气量高是有利于大肠杆菌的生长还是有利于蛋白表达  应不应该怎么通气量来提高目的蛋白表达
3 有的说缩短诱导表达时间到2~3h好  有的说低温长时间诱导表达好   到底应该怎么选才能提高表达量


[ Last edited by donnafeng on 2011-9-19 at 14:47 ]
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1楼 2011-09-19 14:46:30
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imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 17:21:51
引用回帖:
8楼: Originally posted by wlt728 at 2011-09-20 13:00:34:
生长旺盛的时候，细菌的活力强，生长快，自身增值的同时，合成蛋白的速率也快！

纠正一下，事实上在对数期诱导，并不只是因为对数期生长旺盛，而是因为一方面对数期时菌已经能很快长到较高浓度，更重要的是培养液内的营养物质还比较充足。
>>如果对发酵液进行补料，即使是平台期也是可以诱导的。关于这个我们系之前有个老师特地做过实验。
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9楼2011-09-20 15:00:32
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-19 18:04:32
donnafeng(金币+3): 对数生长末期还是中期? 大肠杆菌B21是耗氧的 减少装液量增加转数不是可以增加溶氧吗 2011-09-20 08:05:04
1:应该在对数生长期是诱导，此时菌体生长快速，也能合成更多的目的蛋白。所以你可以做一个生长曲线的实验。2：要是用三角瓶小试的话，你也没法增加通气量啊，如果你的菌是耗氧菌，溶氧过低是会抑制细菌生长的。如果你的目的蛋白是包涵体，可以试试低温诱导，如果不是，一般37℃诱导4h左右就差不多了。我诱导的时候，IPTG终浓度为0.1mM，高浓度IPTG是会抑制菌体生长的！
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I am not a hero , but I served with heroes！
2楼2011-09-19 15:02:41
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lijunqing525

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

donnafeng(金币+1): 没加maker 最粗的那条就是目的 2011-09-20 08:05:51
请问楼主，1、你的MARKER在哪里？2、最粗的那条带是否是你的目的带？
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宠辱不惊，看庭前花开花落；去留无意，看天外云卷云舒。
3楼2011-09-19 15:39:26
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li1977li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-19 18:04:59
donnafeng(金币+5): 谢谢 2011-09-20 08:11:47
wanhscn(金币+1): 鼓励分享！ 2011-09-20 11:45:19
引用回帖:
1楼: Originally posted by donnafeng at 2011-09-19 14:46:30:
BL21诱导表达的蛋白含量不高（ OD0.6~0.8时添加IPTG 浓度0.1mM 28度诱导6h） 请教提高表达的方法
1 IPTG到底什么时候添加 有人说能摇到的最高OD值（大约2.0）一半时添加（即1.0） 有的说0.5的时候添加 到底应该选 ...

1、我们实验室一般在OD为0.6左右加IPTG，这个时期是细菌的对数生长期。（但有一次我在OD=1.0时加表达出的蛋白没看到影响）
2、溶氧量我们一般都不考虑，就在500ml的烧瓶中装200ml的LB诱导。
3、一般采取25—30度诱导，IPTG在0.1—0.4mM左右，低温诱导表达可溶性蛋白可能相对较多，而目的蛋白总量可能会减少，这要根据不同需要，需要摸索不同条件才能找到最大表达量。
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4楼2011-09-19 16:09:44
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