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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于荧光定量PCR要求调成一致RNA浓度的疑问
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tank1917

金虫 (正式写手)

[求助] 关于荧光定量PCR要求调成一致RNA浓度的疑问

诸位大虾：
      小弟不才，荧光定量放了一段时间后又生疏了。这次是想请大家帮忙解惑。
      做荧光定量（两步法），前提条件，是把所有样品的RNA浓度调成一致后，进行反转录，合成cDNA第一链，再进行定量。
      那么，既然cDNA第一链不包含任何信息（小弟的个人理解），需要特异引物才能合成目的基因；同时，考虑到RNA娇气无比。那么，是否可以待到合成了cDNA第一链后，再进行浓度归一化呢？
      qRT新兵，还望诸位大虾不吝赐教！
谢谢
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1楼 2011-09-13 17:22:28
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
那反转录后对模板进行定量到一至，然后再梯度稀释行不行呢
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3楼2011-09-19 22:32:17
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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
tank1917(金币+5): 谢谢您的点拨！的确，小弟没有想到体系中其他组分的干扰。关于逆转录时对RNA的定量，您有什么好的经验分享吗？另：您的ID很像本科时带过我的一个师姐，呵呵。 2011-09-13 17:42:28
dhd997(金币+2): good 2011-09-13 18:09:33
tank1917(金币+15): Thanks！ 2011-09-14 09:39:25
需要在逆转录时对总RNA进行定量，避免CT值差异过大。cDNA定量是不准确的，体系中含有dNTP等，会影响定量结果。
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2楼2011-09-13 17:34:47
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