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tank1917

金虫 (正式写手)

[求助] 关于荧光定量PCR要求调成一致RNA浓度的疑问

诸位大虾:
      小弟不才,荧光定量放了一段时间后又生疏了。这次是想请大家帮忙解惑。
      做荧光定量(两步法),前提条件,是把所有样品的RNA浓度调成一致后,进行反转录,合成cDNA第一链,再进行定量。
      那么,既然cDNA第一链不包含任何信息(小弟的个人理解),需要特异引物才能合成目的基因;同时,考虑到RNA娇气无比。那么,是否可以待到合成了cDNA第一链后,再进行浓度归一化呢?
      qRT新兵,还望诸位大虾不吝赐教!
谢谢
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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
tank1917(金币+5): 谢谢您的点拨!的确,小弟没有想到体系中其他组分的干扰。关于逆转录时对RNA的定量,您有什么好的经验分享吗?另:您的ID很像本科时带过我的一个师姐,呵呵。 2011-09-13 17:42:28
dhd997(金币+2): good 2011-09-13 18:09:33
tank1917(金币+15): Thanks! 2011-09-14 09:39:25
需要在逆转录时对总RNA进行定量,避免CT值差异过大。cDNA定量是不准确的,体系中含有dNTP等,会影响定量结果。
2楼2011-09-13 17:34:47
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)

那反转录后对模板进行定量到一至,然后再梯度稀释行不行呢
3楼2011-09-19 22:32:17
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