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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来
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xintutiao

金虫 (小有名气)

[交流] 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来 已有15人参与

请教各位前辈 PCR的体系是师姐给的，她说一直都用这个，让我做的时候，我总也P不出来 模板是用小枪尖挑的菌落，然后在体系中蘸几下。 不知道为什么 我总是P不出来，P出来的时候很少很少， 我感觉不出来每次做的有什么差异，但是为什么就是P不出来呢？ 谢谢大家了
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1楼 2011-08-23 14:05:23
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3, MicEPI+1): 经验最重要~ 2011-08-25 00:26:03
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系的PCR。剩下做好标号摇起来，提质粒做酶切验证，保藏等。

如果是单拷贝，菌落PCR不好做。

[ Last edited by gwbk on 2011-8-23 at 23:42 ]
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2楼2011-08-23 23:40:57
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+6): 谢谢 2011-08-25 00:26:21
只是蘸取是不行的，要确定体系里有足量的菌，我最近刚做过，发现如果菌少的话也是做不出来的，还有最好在原有预变性温度下增加1分钟，利于细胞裂解，最后电泳检测之前，10000rpm离心五分钟，使菌的裂解碎片完全沉淀，保证电泳是碎片的影响最小，因为有时候电泳菌的碎片会一起随条带前进，感染检测。
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风雪夜归人
4楼2011-08-24 08:45:45
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tianlei1985

铜虫 (小有名气)
我都是用摇完菌后，用菌液做PCR，效果比菌落好，而且简单，10UL体系中加0.5UL菌液即可
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坚持自己的梦想，加油
18楼2011-08-26 18:57:22
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-23 23:40:57:
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系 ...

准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序，提取质粒，菌种保存。屡试不爽。
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
8楼2011-08-25 09:46:40
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 带刀猎人 at 2011-08-25 22:54:45:
同学请不要搞笑！

请问哪里搞笑了？ 我的确碰到过这种情况 预变性5分钟P不出来 10分钟就P出来了
还有楼主的引物对不对 不要搞错了 有没有4°C保存好 不要降解了还在用
还有模板对不对 不要弄错了 比如是重新转的 但是根本就没转化成功
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21楼2011-08-28 19:12:12
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xiaoxiang5

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
菌落PCR
用2u枪的那个枪头蘸取一点，接触到菌落上面即可，量不要太多。
然后用20u反应体系
buffer 2u
dNTP 0.4u
引物 各1u
酶Taq 0.2u
补齐体系20u
条件 参照冷泉港上面的菌落PCR条件
94  4min
94 1min;55 1min;72 2min;35cycles
72 10min;
取10u点样，MARK用7U，我基本可以P出来
祝你好运
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22楼2012-03-13 10:39:48
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普通回帖

redlizi

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我喜欢把菌落先把所有的摇起来再用菌液1-2ul 做PCR，这样不用挑两次菌
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3楼2011-08-24 08:42:12
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xintutiao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-23 23:40:57:
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系 ...

恩 我也觉得 其实每次蘸几下 我也不知道够不够 有时候能做出来 有时候一个都没有
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5楼2011-08-24 17:26:27
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xintutiao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-24 08:45:45:
只是蘸取是不行的，要确定体系里有足量的菌，我最近刚做过，发现如果菌少的话也是做不出来的，还有最好在原有预变性温度下增加1分钟，利于细胞裂解，最后电泳检测之前，10000rpm离心五分钟，使菌的裂解碎片完全沉 ...

我也不知道到底是我蘸多了还是蘸少了 感觉好难把握啊
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6楼2011-08-24 17:27:24
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个，我个人感觉得把ep管底铺满，而且，最好让液体完全浸没菌
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风雪夜归人
7楼2011-08-24 21:32:04
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-25 09:46:40:
准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗 ...

操作标准你来做好了
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9楼2011-08-25 10:44:10
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
预变性时间弄成10分钟
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10楼2011-08-25 18:37:57
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