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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来
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xintutiao

金虫 (小有名气)

[交流] 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来 已有15人参与

请教各位前辈 PCR的体系是师姐给的，她说一直都用这个，让我做的时候，我总也P不出来 模板是用小枪尖挑的菌落，然后在体系中蘸几下。 不知道为什么 我总是P不出来，P出来的时候很少很少， 我感觉不出来每次做的有什么差异，但是为什么就是P不出来呢？ 谢谢大家了
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1楼 2011-08-23 14:05:23
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xiaoxiang5

银虫 (正式写手)
★
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菌落PCR
用2u枪的那个枪头蘸取一点，接触到菌落上面即可，量不要太多。
然后用20u反应体系
buffer 2u
dNTP 0.4u
引物 各1u
酶Taq 0.2u
补齐体系20u
条件 参照冷泉港上面的菌落PCR条件
94  4min
94 1min;55 1min;72 2min;35cycles
72 10min;
取10u点样，MARK用7U，我基本可以P出来
祝你好运
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22楼2012-03-13 10:39:48
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3, MicEPI+1): 经验最重要~ 2011-08-25 00:26:03
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系的PCR。剩下做好标号摇起来，提质粒做酶切验证，保藏等。

如果是单拷贝，菌落PCR不好做。

[ Last edited by gwbk on 2011-8-23 at 23:42 ]
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2楼2011-08-23 23:40:57
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redlizi

木虫 (正式写手)
★
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我喜欢把菌落先把所有的摇起来再用菌液1-2ul 做PCR，这样不用挑两次菌
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3楼2011-08-24 08:42:12
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+6): 谢谢 2011-08-25 00:26:21
只是蘸取是不行的，要确定体系里有足量的菌，我最近刚做过，发现如果菌少的话也是做不出来的，还有最好在原有预变性温度下增加1分钟，利于细胞裂解，最后电泳检测之前，10000rpm离心五分钟，使菌的裂解碎片完全沉淀，保证电泳是碎片的影响最小，因为有时候电泳菌的碎片会一起随条带前进，感染检测。
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风雪夜归人
4楼2011-08-24 08:45:45
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