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xintutiao

金虫 (小有名气)

[交流] 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来 已有15人参与

请教各位前辈 PCR的体系是师姐给的,她说一直都用这个,让我做的时候,我总也P不出来 模板是用小枪尖挑的菌落,然后在体系中蘸几下。 不知道为什么 我总是P不出来,P出来的时候很少很少, 我感觉不出来每次做的有什么差异,但是为什么就是P不出来呢? 谢谢大家了
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-23 23:40:57:
体系是她给你的,她如果能做出来,你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落(质粒多拷贝),溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中,混匀抽1-3ul做50ul体系 ...

准备灭菌PCR管和无菌水,取10ul无菌水至PCR管中,枪头挑取菌落(DH5a,BL21)至PCR管中,吹打混匀。取3ul做PCR(25ul体系),剩余7ul菌落悬浮液,4度保存。PCR验证阳性克隆后,将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序,提取质粒,菌种保存。屡试不爽。
不放弃,日子总有阳光,追求总有希望!
8楼2011-08-25 09:46:40
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gwbk

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
scelab(金币+3, MicEPI+1): 经验最重要~ 2011-08-25 00:26:03
体系是她给你的,她如果能做出来,你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落(质粒多拷贝),溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中,混匀抽1-3ul做50ul体系的PCR。剩下做好标号摇起来,提质粒做酶切验证,保藏等。

如果是单拷贝,菌落PCR不好做。

[ Last edited by gwbk on 2011-8-23 at 23:42 ]
2楼2011-08-23 23:40:57
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redlizi

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
我喜欢把菌落先把所有的摇起来再用菌液1-2ul 做PCR,这样不用挑两次菌
3楼2011-08-24 08:42:12
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
scelab(金币+6): 谢谢 2011-08-25 00:26:21
只是蘸取是不行的,要确定体系里有足量的菌,我最近刚做过,发现如果菌少的话也是做不出来的,还有最好在原有预变性温度下增加1分钟,利于细胞裂解,最后电泳检测之前,10000rpm离心五分钟,使菌的裂解碎片完全沉淀,保证电泳是碎片的影响最小,因为有时候电泳菌的碎片会一起随条带前进,感染检测。
风雪夜归人
4楼2011-08-24 08:45:45
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