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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来
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yguang

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
肯定跟菌的多少没关系，还是找体系里其他东西的原因吧！
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11楼2011-08-25 20:24:15
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带刀猎人

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by xt123xt at 2011-08-25 18:37:57:
预变性时间弄成10分钟

同学请不要搞笑！
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12楼2011-08-25 22:54:45
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xintutiao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-24 08:45:45:
只是蘸取是不行的，要确定体系里有足量的菌，我最近刚做过，发现如果菌少的话也是做不出来的，还有最好在原有预变性温度下增加1分钟，利于细胞裂解，最后电泳检测之前，10000rpm离心五分钟，使菌的裂解碎片完全沉 ...

请教您一下，如果菌的碎片在电泳中一起前进的话，那它在EB染后 紫外灯的照射下能显色吗？具体的干扰是什么呢？谢谢您了
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13楼2011-08-26 10:16:11
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
因为菌裂解后有些蛋白就进入体系而蛋白在紫外下也是显色的，故而会有影响，会看到一长条亮的，可能就遮盖住你的目的片段了。碎片的话也可能存在一些莫名奇妙的现象。
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风雪夜归人
14楼2011-08-26 10:30:38
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tcguobing

银虫 (初入文坛)
不行就做菌液PCR
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15楼2011-08-26 18:34:22
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忽必烈
16楼2011-08-26 18:41:56
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忽必烈
17楼2011-08-26 18:42:04
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tianlei1985

铜虫 (小有名气)
我都是用摇完菌后，用菌液做PCR，效果比菌落好，而且简单，10UL体系中加0.5UL菌液即可
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坚持自己的梦想，加油
18楼2011-08-26 18:57:22
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xintutiao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-26 10:30:38:
因为菌裂解后有些蛋白就进入体系而蛋白在紫外下也是显色的，故而会有影响，会看到一长条亮的，可能就遮盖住你的目的片段了。碎片的话也可能存在一些莫名奇妙的现象。

哦 这样啊 太感谢啦 谢谢谢谢
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19楼2011-08-27 09:18:55
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xintutiao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-23 23:40:57:
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系 ...

请教这位前辈，我做完转化后，挑了蓝白筛选中的单个白斑，做菌落PCR，为什么只有引物二聚体，其他都没有呢，marker很明显，我用的是大肠杆菌DH5α感受态，这不是应该很容易P出来吗？

[ Last edited by xintutiao on 2011-8-27 at 16:15 ]
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20楼2011-08-27 16:13:58
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