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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 带刀猎人 at 2011-08-25 22:54:45:
同学请不要搞笑！

请问哪里搞笑了？ 我的确碰到过这种情况 预变性5分钟P不出来 10分钟就P出来了
还有楼主的引物对不对 不要搞错了 有没有4°C保存好 不要降解了还在用
还有模板对不对 不要弄错了 比如是重新转的 但是根本就没转化成功
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21楼2011-08-28 19:12:12
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xiaoxiang5

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
菌落PCR
用2u枪的那个枪头蘸取一点，接触到菌落上面即可，量不要太多。
然后用20u反应体系
buffer 2u
dNTP 0.4u
引物 各1u
酶Taq 0.2u
补齐体系20u
条件 参照冷泉港上面的菌落PCR条件
94  4min
94 1min;55 1min;72 2min;35cycles
72 10min;
取10u点样，MARK用7U，我基本可以P出来
祝你好运
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22楼2012-03-13 10:39:48
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wllxo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
用蘸的，结果太没保证了。我们每次做的时候，用的都是培养过夜的菌液，培养时间大概在14-16h之间，加入量为1ul（20ul体系），你试试吧！
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23楼2012-03-13 14:17:56
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
605921楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-25 09:46:40
准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性 ...

如果只取这么少量的单菌落做pcr检测，验证了阳性克隆后，再取原来培养皿里培养的菌落做液体培养，之前的检测能代表整个培养皿的菌落吗？偶也准备做这个，但不是很懂。

[ Last edited by 曾经遥远 on 2012-8-11 at 11:19 ]
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选择了就不要放弃
24楼2012-08-11 11:18:16
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的第一感觉有两个原因
一个是菌体量，菌体量太多或者太少都可能导致扩增不出。我之前做16SDNA菌落PCR种属鉴定的时候就用牙签轻轻蘸一下就能P出了，如果菌体量太多的话可能导致扩增不出，道理和http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4765321相似
第二个可能是预变性时间不够，正如楼上所说。因为革兰氏阴性和阳性菌的细胞壁结构不一样，革兰氏阳性细胞壁厚且肽聚糖层交联度高，应该更难破裂。但是如果你师姐之前用的菌和你用的菌是一样的，就可以排除这种可能了。
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非淡泊无以明志，非宁静无以致远。
25楼2012-08-12 23:53:08
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4655265楼: Originally posted by 曾经遥远 at 2012-08-11 11:18:16
如果只取这么少量的单菌落做pcr检测，验证了阳性克隆后，再取原来培养皿里培养的菌落做液体培养，之前的检测能代表整个培养皿的菌落吗？偶也准备做这个，但不是很懂。
...

你应该是做转化的吧，一下说法针对转化而言
验证了阳性克隆只是验证了你当初挑取的那个单菌落是阳性的，培养皿里面其他的单菌落并不能够确定。
而且菌落PCR假阳性率挺高的，如果菌落PCR引物设计上游和下游引物都是从外源片段设计的，那就更危险了，为了确保不是假阳性最好提质粒做一次酶切验证。
所以你挑取菌落液体培养的时候挑取的只能是你做了PCR验证了的那个菌落，并不能代表整个培养皿里的所有菌落。
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非淡泊无以明志，非宁静无以致远。
26楼2012-08-13 00:00:24
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4656125楼: Originally posted by wuyuan1992 at 2012-08-13 00:00:24
你应该是做转化的吧，一下说法针对转化而言
验证了阳性克隆只是验证了你当初挑取的那个单菌落是阳性的，培养皿里面其他的单菌落并不能够确定。
而且菌落PCR假阳性率挺高的，如果菌落PCR引物设计上游和下游引物都 ...

这样的啊，学习了。谢谢咯
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选择了就不要放弃
27楼2012-08-13 00:18:58
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4656128楼: Originally posted by 曾经遥远 at 2012-08-13 00:18:58
这样的啊，学习了。谢谢咯...

28楼2012-08-13 00:30:50
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ambershao07

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌落蘸取用TE溶解，或者100度加热冷却，再离心，取上清液1到3u你都试一下。
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29楼2014-11-27 13:25:50
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