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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来
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xintutiao

金虫 (小有名气)

[交流] 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来 已有15人参与

请教各位前辈 PCR的体系是师姐给的，她说一直都用这个，让我做的时候，我总也P不出来 模板是用小枪尖挑的菌落，然后在体系中蘸几下。 不知道为什么 我总是P不出来，P出来的时候很少很少， 我感觉不出来每次做的有什么差异，但是为什么就是P不出来呢？ 谢谢大家了
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1楼 2011-08-23 14:05:23
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4655265楼: Originally posted by 曾经遥远 at 2012-08-11 11:18:16
如果只取这么少量的单菌落做pcr检测，验证了阳性克隆后，再取原来培养皿里培养的菌落做液体培养，之前的检测能代表整个培养皿的菌落吗？偶也准备做这个，但不是很懂。
...

你应该是做转化的吧，一下说法针对转化而言
验证了阳性克隆只是验证了你当初挑取的那个单菌落是阳性的，培养皿里面其他的单菌落并不能够确定。
而且菌落PCR假阳性率挺高的，如果菌落PCR引物设计上游和下游引物都是从外源片段设计的，那就更危险了，为了确保不是假阳性最好提质粒做一次酶切验证。
所以你挑取菌落液体培养的时候挑取的只能是你做了PCR验证了的那个菌落，并不能代表整个培养皿里的所有菌落。
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非淡泊无以明志，非宁静无以致远。
26楼2012-08-13 00:00:24
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
scelab(金币+3, MicEPI+1): 经验最重要~ 2011-08-25 00:26:03
体系是她给你的，她如果能做出来，你就肯定也能。菌量太多可能做不出来~~~蘸几下是一个很笼统的概念。我一般挑16-20h左右的中等面积菌落（质粒多拷贝），溶解到预备好的PCR管10ul无菌水中，混匀抽1-3ul做50ul体系的PCR。剩下做好标号摇起来，提质粒做酶切验证，保藏等。

如果是单拷贝，菌落PCR不好做。

[ Last edited by gwbk on 2011-8-23 at 23:42 ]
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2楼2011-08-23 23:40:57
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redlizi

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我喜欢把菌落先把所有的摇起来再用菌液1-2ul 做PCR，这样不用挑两次菌
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3楼2011-08-24 08:42:12
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+6): 谢谢 2011-08-25 00:26:21
只是蘸取是不行的，要确定体系里有足量的菌，我最近刚做过，发现如果菌少的话也是做不出来的，还有最好在原有预变性温度下增加1分钟，利于细胞裂解，最后电泳检测之前，10000rpm离心五分钟，使菌的裂解碎片完全沉淀，保证电泳是碎片的影响最小，因为有时候电泳菌的碎片会一起随条带前进，感染检测。
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风雪夜归人
4楼2011-08-24 08:45:45
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