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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母重组子筛选引物问题
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finding1371

银虫 (小有名气)

[求助] 酵母重组子筛选引物问题

见论坛里提及筛选重组子的引物有的说用专用检测引物，有的说一条用特异性引物一条用专用引物。若是一条专用引物和一条特异性引物，但是这两者的引物长度差近10个碱基。退火温度也相差好远，能批吗，到底是什么样的情况呢，谢谢大家了
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1楼 2011-08-19 11:31:30
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-19 15:50:39
finding1371(金币+10): 谢谢，请教模板是提取出总DNA但是用菌落呢 2011-08-19 17:09:17
遇到这种情况就用你的那对特异性引物P也可以的，不一定药一条用特异性引物一条用专用引物的。
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2楼2011-08-19 13:58:46
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finding1371

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-19 13:58:46:
遇到这种情况就用你的那对特异性引物P也可以的，不一定药一条用特异性引物一条用专用引物的。

有没有较为方便的模板可供参考啊，阳性克隆子长的较多，逐个提取不现实，
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3楼2011-08-19 17:10:45
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
西瓜(金币+1): Good！欢迎专家归来！ 2011-08-19 23:24:24
酵母做菌落PCR很难的，一般提取基因组DNA做模板。
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4楼2011-08-19 21:13:09
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): 经验很多啊 2011-08-19 23:25:01
西瓜(金币+4, MolEPI+1): 经验很多啊 2011-08-19 23:25:03
引用回帖:
3楼: Originally posted by finding1371 at 2011-08-19 17:10:45:
有没有较为方便的模板可供参考啊，阳性克隆子长的较多，逐个提取不现实，

你可以用煮-冻-煮方法试试，很多人说比较简单的。
煮-冻-煮法：将1mL菌液2 500 X g离心5 min,弃上清，沉淀中加入500 uL TE悬浮沉淀，2500Xg离心3m in;弃上清，重复一次，最后沉淀溶于100 uLTE,沸水浴10 min，-20℃冷冻30 min,再次沸水浴10 min, 1 500 X g离心5 min,取上清为模板作PCR。
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5楼2011-08-19 21:15:30
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-19 21:13:09:
酵母做菌落PCR很难的，一般提取基因组DNA做模板。

不难吧，我觉的挺简单吧，虽然我不常做，但是做过的有限几次还真没有失手过
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6楼2011-08-19 23:39:24
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
模板制做方法：
1.取40ul无菌水于1.5ml Ep管中
2.牙签轻点单菌落，然后在无菌水中刷几下
3.Ep管盖了盖子，沸水浴5分钟
4.1200rpm离心2min，上清即是模板，20ul的pcr体系使用4ul做模板
以上方法做过有限的几次都没有失手过
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7楼2011-08-19 23:45:42
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