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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化后无结果
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lalafeng

银虫 (小有名气)

[求助] 连接转化后无结果

我的连接体系是：
目的片段1212bp：11u
质粒pET30:6u
T4连接酶：1u
Buffer:2u
这是我借鉴同学经常使用的体系，化转后在卡纳抗生素板上挑单菌落摇提质粒验证，板上的菌和大肠杆菌形态一样，气味也对的，挑了8个可是竟然都提不出质粒，我的表达宿主是BL21，试剂盒没问题，请高手指点，谢谢！
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充实每一天，学会自控
1楼 2011-08-12 21:21:34
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-08-13 00:38:06
我们实验室的体系：楼主可以试一下目的片段1212bp：1ul
质粒pET30:6u或3.5ul
T4连接酶：1u
Buffer:2u
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-12 22:24:59
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tingl0087

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lalafeng(金币+4): 2011-08-14 11:36:48
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 说得简单明了，就是这样！ 2011-08-15 13:11:54
lalafeng(金币+1): 2011-08-16 09:56:04
这个要看目的基因与载体的摩尔比吧，分别跑电泳，根据marker估算下目的基因和载体大概有多少ng，然后分别除以它们的分子量算出来摩尔数，我们一般连接时目的基因与载体的摩尔比在3:1到10:1之间，20ul体系
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3楼2011-08-13 19:10:19
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
lalafeng(金币+1): 2011-08-14 11:36:57
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-08-15 13:11:16
要看摩尔数，第一次做按说明书里提供的比例把
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4楼2011-08-13 21:17:18
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lalafeng

银虫 (小有名气)
非常感谢各位的建议
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充实每一天，学会自控
5楼2011-08-15 09:52:30
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