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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 根据已知序列，从相同菌种(菌株编号不同)中能PCR出目的基因吗？
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

[求助] 根据已知序列，从相同菌种(菌株编号不同)中能PCR出目的基因吗？

本人目前要构建一株产D-氨基酰化酶的工程菌，从NCBI可以查到该酶的核酸序列，相应的产酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本实验室没有该菌株，而能买到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它也可以产D-氨基酰化酶，不过网上没查到它的酶核酸序列。如果我按Alcaligenes faecalis DA1的酶核酸序列，设计引物，用Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)的基因组DNA作模板，可不可以P出目的基因呢？Alcaligenes faecalis DA1中DA1是文献作者的编号。
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飞翔的诗人

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1楼2011-08-08 17:05:48
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-08 18:13:55
飞翔的诗人(金币+8): 指出了解决问题的方法 2011-08-09 16:07:23
如果保守的话就没有问题，做一些比对，然后设计简并引物
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2楼2011-08-08 17:29:34
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 最近很活跃啊，鼓励之 2011-08-08 18:14:14
飞翔的诗人(金币+2): 非常详细的解答 2011-08-09 16:08:25
引用回帖:
1楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-08 17:05:48:
本人目前要构建一株产D-氨基酰化酶的工程菌，从NCBI可以查到该酶的核酸序列，相应的产酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本实验室没有该菌株，而能买到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它 ...

一般来说同一个种不同菌株的基因序列应该高度保守，按照已报道序列设计引物扩增应该没有问题，除非报道的序列有问题，可以先比对一下看看D-氨基酰化酶编码基因的相似性，最好同时设计一对简并引物进行PCR扩增。
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3楼2011-08-08 17:56:45
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
第二位回答的更详细，呵呵，第一次发，没弄明白发金币的规则，看来我还是得设计简并引物了。按目前查到的酶核酸序列设计引物，是将编码区全部P出来，还是只P编码区的一部分呢。看文献发现有好多引物设计表达酶时，上游引物都是直接从起始密码ATG开始的一段序列，下游引物从终止密码开始的一段序列，也就是把编码区都P出来了，这样感觉不怎么用软件也可以设计了引物了，我查到酶序列就只有编码区，所以是不是也可以这么做呢？
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4楼2011-08-09 16:23:34
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
你可以先按照已经报道的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基酰化酶编码基因设计特异引物，进行PCR扩增，如果能扩增出来就没有必要设计简并引物的。如果没有扩增出来的话再来考虑设计简并引物。

你要表达Alcaligenes faecalis DA1D-氨基酰化酶的话，肯定要先把D-氨基酰化酶编码基因的全序列（包括起始密码和终止密码）扩增出来，可以把序列克隆到T-载体中长期保存，如果要构建高产菌株的话，你同时要考虑载体上有没有合适的启动子，如果没有的话，你可以把把D-氨基酰化酶的启动子序列一起克隆到载体里面进行表达。

祝好运！
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5楼2011-08-09 16:59:18
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
非常感谢，这样我就放心了，不过由于查到的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基酰化酶序列只有CDS区（只有一个报道的）， 这样设计引物就没得选择，只能是从ATG开始的一段序列，以及终止密码前的一段序列了（用软件看这两段引物得分都很低，可能不好P）。最后还想请教一下如何选择载体，比如怎么判断载体上有没有合适的启动子，我打算就用实验室的PET 30a做表达，下面附上了我查到的目的序列，非常感谢！

FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..1455
                     /organism="Alcaligenes faecalis"
                     /mol_type="genomic DNA"
                     /db_xref="taxon:511"
     CDS             1..1455
                     /EC_number="3.5.1.81"
                     /note="DaaAF"
                     /codon_start=1
                     /transl_table=11
                     /product="D-aminoacylase"
                     /protein_id="AAK15530.1"
                     /db_xref="GI:13194736"
                     /translation="MSQPDATPFDYILSGGTVIDGTNAPGRLADVGVRGDRIAAVGDLSASSARRRIDVAGKVVSPGFIDSHTHDDNYLLKHRDMTPKISQGVTTVVTGNCGISLAPLAHANPPAPLDLLDEGGSFRFARFSDYLEALRAAPPAVNAACMVGHSTLRAAVMPDLRREATADEIQAMQALADDALASGAIGISTGAFYPPAAHASTEEIIEVCRPLITHGGVYTHMRDEGEHIVQALEETFRIGRELDVPVVISHHKVMGKLNFGRSKETLALIEAAMASQDVSLDAYPYVAGSTMLKQDRVLLAGRTLITWCKPYPELSGRDLEEIAAERGKSKYDVVPELQPAGAIYFMMDEPDVQRILAFGPTMIGSDGLPHDERPHPRLWGTFPRVLGHYSRDLGLFPLETAVWKMTGLTAAKFGLAERGQVQPGYYADLVVFDPATVADSATFEHPTERAAGIHSVYVNGAAVWEDQSFTGQHAGRVLNRAGA"
ORIGIN      
        1 atgtcccagc ccgacgccac cccgttcgac tacatacttt ccggcggcac cgtcatcgac
      61 ggcacgaacg cgccaggccg gctcgccgac gtgggcgtgc ggggcgatcg gattgccgcc
     121 gtcggcgacc tgagcgccag cagcgcccgc cggcgcatcg acgtggcggg aaaagtggtg
     181 tctccgggct tcatcgactc gcacacgcat gacgacaact acctgctgaa acaccgcgac
      241 atgacgccca agatctcgca gggcgtcacc accgtggtca cgggcaactg cggtatcagt
      301 ctcgccccgc tggcgcacgc caatccgccc gcgccgctgg atctgctgga cgaaggcggc
      361 tcgttccgct ttgcacgctt ctcggactac ctcgaagccc tgcgcgccgc gccgcctgcc
      421 gtcaacgccg cctgcatggt gggccattcc accctgcgcg ccgccgtcat gcccgacttg
      481 cggcgcgaag ccacggccga tgaaatccag gccatgcagg cgctggccga cgatgcgctg
      541 gccagtggcg ccatcggcat ttccacaggc gccttctatc cgcccgccgc ccatgccagc
      601 accgaggaaa tcatcgaagt ctgccgcccc ctgatcacgc atggcggcgt ctacgccacc
      661 catatgcgcg atgagggcga acatatcgtc caggcgctgg aggagacctt ccgcatcggc
      721 cgcgaactgg acgtgccggt cgttatctcg caccacaagg tcatgggcaa gctcaatttc
      781 gggcgctcca aggaaacgct ggccttgatc gaggcggcca tggccagcca ggacgtatcg
      841 ctggacgcct atccctacgt ggcgggctcc accatgctca agcaggaccg cgtcctgctt
      901 gccggccgca cgcttatcac ctggtgcaag ccctatcccg aactgagcgg acgcgacctg
      961 gaagaaatcg ccgccgagcg aggcaagtcc aagtacgacg tggtgcccga actgcagccc
     1021 gccggcgcca tctacttcat gatggacgag cccgacgtgc agcgcatcct ggcgttcggc
     1081 cccaccatga tcgggtccga tggcctgccc cacgacgagc gcccccaccc tcgcctgtgg
     1141 ggaacgtttc cccgggtgct gggccactac tcgcgcgacc tgggcctgtt cccattggag
     1201 accgcggtct ggaaaatgac cggcctgacc gccgccaaat tcggcctggc cgaacggggc
     1261 caggtgcagc ccggctacta cgccgacctg gtggtcttcg acccggccac ggtggcggac
     1321 tcggccacgt tcgagcatcc caccgagcgc gccgcgggca tccattcggt ctacgtcaac
     1381 ggcgcggccg tctgggaaga ccagtcgttc actggccagc atgccggccg cgtcctcaac
     1441 cgggccggag cctga
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6楼2011-08-10 15:41:40
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
基因又不大，你全合成不就得了，花不了多少钱，关键是速度快，还可以让基因公司直接给你合成出你需人的酶切位点。
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7楼2014-11-11 13:58:41
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