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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

[求助] 根据已知序列，从相同菌种(菌株编号不同)中能PCR出目的基因吗？

本人目前要构建一株产D-氨基酰化酶的工程菌，从NCBI可以查到该酶的核酸序列，相应的产酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本实验室没有该菌株，而能买到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它也可以产D-氨基酰化酶，不过网上没查到它的酶核酸序列。如果我按Alcaligenes faecalis DA1的酶核酸序列，设计引物，用Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)的基因组DNA作模板，可不可以P出目的基因呢？Alcaligenes faecalis DA1中DA1是文献作者的编号。
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飞翔的诗人

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1楼2011-08-08 17:05:48
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 最近很活跃啊，鼓励之 2011-08-08 18:14:14
飞翔的诗人(金币+2): 非常详细的解答 2011-08-09 16:08:25
引用回帖:
1楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-08 17:05:48:
本人目前要构建一株产D-氨基酰化酶的工程菌，从NCBI可以查到该酶的核酸序列，相应的产酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本实验室没有该菌株，而能买到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它 ...

一般来说同一个种不同菌株的基因序列应该高度保守，按照已报道序列设计引物扩增应该没有问题，除非报道的序列有问题，可以先比对一下看看D-氨基酰化酶编码基因的相似性，最好同时设计一对简并引物进行PCR扩增。
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3楼2011-08-08 17:56:45
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-08 18:13:55
飞翔的诗人(金币+8): 指出了解决问题的方法 2011-08-09 16:07:23
如果保守的话就没有问题，做一些比对，然后设计简并引物
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2楼2011-08-08 17:29:34
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
第二位回答的更详细，呵呵，第一次发，没弄明白发金币的规则，看来我还是得设计简并引物了。按目前查到的酶核酸序列设计引物，是将编码区全部P出来，还是只P编码区的一部分呢。看文献发现有好多引物设计表达酶时，上游引物都是直接从起始密码ATG开始的一段序列，下游引物从终止密码开始的一段序列，也就是把编码区都P出来了，这样感觉不怎么用软件也可以设计了引物了，我查到酶序列就只有编码区，所以是不是也可以这么做呢？
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4楼2011-08-09 16:23:34
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
你可以先按照已经报道的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基酰化酶编码基因设计特异引物，进行PCR扩增，如果能扩增出来就没有必要设计简并引物的。如果没有扩增出来的话再来考虑设计简并引物。

你要表达Alcaligenes faecalis DA1D-氨基酰化酶的话，肯定要先把D-氨基酰化酶编码基因的全序列（包括起始密码和终止密码）扩增出来，可以把序列克隆到T-载体中长期保存，如果要构建高产菌株的话，你同时要考虑载体上有没有合适的启动子，如果没有的话，你可以把把D-氨基酰化酶的启动子序列一起克隆到载体里面进行表达。

祝好运！
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5楼2011-08-09 16:59:18
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