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luge611

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR扩到了基因上下游片段却扩不到全长，恳请高手指点帮助

PCR扩增未知基因全长（从真菌cDNA中扩）
已知该基因的保守区，且通过PCR扩到（假定设计的引物为F1，R1）。根据已报道同源基因设计的全长引物（假定为F2，R2），PCR得不到全长。尝试了改变模板浓度、引物浓度，温度梯度、touchdown PCR，均没有扩出。
最后，尝试分别用F2和R1，F1和R2为引物（即两对引物交叉使用，PCR条件基本合适），扩到了基因的上下游片段，且上下游片段有500bp左右的重叠区。把两个片段拼接后与同源基因比对，匹配度达到86%，根据拼接后的序列又重新设计了一对全长引物（F3，R3），结果PCR还是扩不到。尝试了改变PCR的各种条件，还是不行。
已经分析，模板、酶、buffer都应该没问题（因为用同样条件两个片段都扩得到），引物用oligo分析也可以，退火温度从低到高都试了，也做了touchdown可就是扩不到。把两个片段作为模板做PCR却扩得到。有可能是刚好扩到了两个基因的片段吗？可比对了同属真菌的同类基因没有同源性这么高的。
不知道问题出在哪里，还请高手们给分析分析，支个招啊！

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1楼 2011-08-01 16:35:35

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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

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引用回帖:

1楼: Originally posted by luge611 at 2011-08-01 16:35:35:
PCR扩增未知基因全长（从真菌cDNA中扩）
已知该基因的保守区，且通过PCR扩到（假定设计的引物为F1，R1）。根据已报道同源基因设计的全长引物（假定为F2，R2），PCR得不到全长。尝试了改变模板浓度、引物浓度 ...

一般不会出现这种情况呀，难道是序列中有一段的GC含量特别高吗？

认真检查一下序列，看看有没有GC含量特别高的片段！