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【资料】分子生物学常见问题解答
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1、基因组DNA 的得率较低或者无基因组DNA 原因，如何解决？ 1) 样品材料老化或者反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能立即处理的样品应放入液氮或-70℃低温保存，以免DNA 降解。 2) 样品破壁或者裂解不完全，DNA 未充分释放：动植物样品应在液氮中充分研磨，G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方法协助破壁。 3) 样品过多导致细胞裂解不充分：加样过多导致细胞裂解不充分，细胞裂解不充分。 4) DNA 吸附不均匀：如在上吸附柱前没有加无水乙醇，或使用低浓度乙醇代替无水乙醇，会导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶模吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量的无水乙醇，再上吸附柱使DNA 与硅胶模充分吸附。 5) DNA 洗脱不适当：洗脱缓冲液pH 过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。洗脱液体积过少（<30μl），不易浸透硅胶模，使DNA不能洗脱下来，因此洗脱液体积应大于30μl，超过200μl，所得的DNA 浓度降低。洗脱时可以将洗脱液于65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率，加大DNA 产量。 2、基因组DNA 质量测定的问题分析。 采用分光分度测定时OD260/OD280 比值1.8，说明大量RNA 残留，没有使用RNase A，或RNase A 活性下降。 3、提取的基因组DNA 有降解，如何解决？ 选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液或不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或者低温保存的样品经反复冻融导致细胞破碎，内源性核酸酶降解DNA，因此应该选用新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中应该使用干冰。 1) 未能有效的抑制内源性核酸酶的作用：某些DNase含量丰富的动植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过称中随时补充液氮，并在样品未完全解冻之前加入含有抑制核酸酶作用的裂解液。 2) 操作过于剧烈导致DNA被机械打断：预处理的样品应该加入细胞裂解以后，所有操作应该尽量柔和，避免剧烈振荡。 4、提取的基因组DNA 不能顺利的进行后继实验，如何解决？ 得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进行，主要原因为DNA 样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA 聚合酶的活性： 1) 样品过多导致细胞裂解不充分：裂解液不能有效与样品混合，导致裂解不彻底，残留大量蛋白、多糖、脂类等杂质，为后继的上吸附柱分离纯化造成影响。 2) DNA 洗脱前，有大量乙醇残留：有机溶剂乙醇可严重的抑制内切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA过柱洗涤过程中均使用含有乙醇的去蛋白液和漂洗液，因此在洗脱 DNA前，一定要充分去除残留的乙醇，再加洗脱液。 5、提取的基因组DNA 有RNA 污染，如何解决？ 得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进行，主要因为DNA 样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA 聚合酶的活性。 1) 实验过程中没有有效使用RNase A，应严格按照实验要求进行。 2) RNase A 失活：RNase A 应该于-20℃下保存，低温保存时RNase A 比较稳定，不易失活，但是反复冻融会影响其活性。 6、未提出质粒或质粒得率较低原因？ 1) 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2) 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体 。 3) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4) 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分。 5) 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。 6) 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 7) 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。 8) 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 9) 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris•Cl，pH 8.5) 或水。洗脱效率取决于pH 值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。 7、质粒纯度不高的原因？ 1) 混有蛋白：不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3 处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。 2) 混有RNA：RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6 个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。 3) 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA 的降解，不要超过16h。 4) 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8、DNA 在上样电泳时溢出点样孔，如何解决？ 质粒 DNA 产物中残留酒精；漂洗液洗涤后应尽量除去结合柱中残留液体，适当晾干吸附柱。 9、RNA 提取时RNA 降解原因？ 1) 新鲜细胞：裂解液的量不足，使得裂解不充分。 2) 新鲜组织：某些含有内源性核酸酶的样品，很难避免RNA 酶的降解，建议采用的方法为在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时采用更多的裂解液。 3) 冷冻样品：样品取材后应该迅速置于液氮中冷冻存放，然后转移到-70℃冰箱存放。如果未经液氮速冷直接转移到-70℃冰箱存放，会造成RNA 缓慢降解。样品研磨后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 4) 外源RNA 酶的污染：试剂、器械等实验用品应该采用DEPC 水灭菌处理。 5) 内源RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多或者匀浆温度过高。 10、OD260/OD280 比值偏低原因？ 1) 蛋白质污染：确保不要吸入中间层以及有机相；减少样品起始量，确保裂解完全。加入氯仿后会充分混匀，离心的转速和时间要合适，如果一次抽提不彻底，可使用氯仿重新抽提一次。 2) 多糖或多酚残留：一些特殊的组织和植物中，多糖和多酚含量较多，会导致OD260/OD280比值偏低。 3) 测定方式的差异：测定OD260以及OD280数值时，要使OD260读数于0.1-0.5之间，此曲线线性范围最好；用水稀释样品，测定的比值要比TE 稀释的比值偏低。 11、RNA 提取得率偏低原因？ 1) 组织或细胞中RNA含量偏低：不同细胞或者组织中RNA的丰度不一样，RNA提取量也不一致。 2) 样品起始量太少或者太多：样品起始量太少，则细胞组织中RNA含量较低，样品过多则超过裂解液的裂解能力，使得裂解不完全，从而RNA得率低。 12、PCR反应出现假阴性结果，无扩增条带原因？ PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。可能出现的原因有以下几点： 1) 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 2) 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 3) 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 4) Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 5) 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多大体积进行PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 6) 物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 7) 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 13、PCR反应出现假阳性结果原因？ 1) 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2) 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 14、PCR反应出现非特异性扩增带的原因与对策是什么？ PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。可能出现的原因有以下几点： 1) 引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。 2) Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR 循环次数过多有关。 3) 其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 4) 其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法 (93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 15、PCR反应出现片状拖带或涂抹带原因？ 1) PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 2) 其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+ 浓度。增加模板量，减少循环次数。 16、克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。4：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8 或8：1 也行。应测定比值范围。连接用5μL2X 连接液，50ng 质粒DNA，1Weiss 单位的T4连接酶，插入片段共10μL。室温保温1h，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1h能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。 17、PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 18、如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ 涂布未转化的感受态细胞：如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 1) 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率：例如：将1ug/μL 质粒1:100 稀释，1μL 用于100ul 感受态细胞转化。用SOC 稀释到1000μL 后，用100μL 铺板。培养过夜，产生1000 个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA 的总量。 2) 如用pGEM-T 正对照，或PCR 产物，产生>20-40 蓝斑（用指定步骤108cfu/ ug 感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 3) 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（108cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40 蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 · [ Last edited by silicare on 2012-12-15 at 11:46 ] |
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