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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR与普通PCR产物不一样？
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yaomoon

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR与普通PCR产物不一样？

我做荧光定量PCR,用Oligo6 设计的基因引物，扩增片段长度为91bp, 扩增产物的Tm值79.9。我先用普通PCR进行扩增，扩增条件为94℃,5min; 94℃.30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s; 35个循环； 72℃ 10min。扩增的产物电泳检测后发现有200多bp并且只有一条带（具体图没有拍下来）。但是我同样的引物在荧光定量pcr仪上扩增其溶解曲线的Tm值为79℃多一点，基本与我设计的一致。具体图见附件。（其中荧光定量的扩增条件与普通PCR不太一样，我是采用的Takara试剂盒说明书上的两步法）。请问这是怎么一回事？

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1楼 2011-07-24 08:33:13
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-07-24 19:28:24
如果想确认怎么回事，两个结果都拿去测序，就出来了

再拿RT-PCR的结果跑电泳是不准的，虽然我也跑过，差不多，但是毕竟结合了sybgreen，迁移率还是不一样的，只是示意一下的
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4楼2011-07-24 10:51:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-24 19:28:10
yaomoon(金币+3): 谢谢您的回帖，我会再进行核对，并进一步比较Q-PCR和普通PCR的电泳结果。 2011-07-25 20:39:55
1.你设计的引物本来应该扩出91bp但你扩的产物是200多bp，并且从你的溶解曲线图上可以看出你设计的引物特异性非常好，所以请你确认你的原始模板信息是否完全正确。
2.既然你做普通PCR和q-pcr用的引物及模板是完全一样的，那么扩增的片段是完全一样的
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-07-24 10:06:58
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-24 19:28:17
溶解曲线很好，
但是你怎么肯定你RT-PCR的结果的bp数目？
我记得好像RT-PCR没有办法显示扩增片段大小吧？也许这就是200bp的呢？

普通pcr不过关，估计还是你引物设计有问题，建议从这里入手
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3楼2011-07-24 10:49:23
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yaomoon

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cdl007 at 2011-07-24 10:51:35:
如果想确认怎么回事，两个结果都拿去测序，就出来了

再拿RT-PCR的结果跑电泳是不准的，虽然我也跑过，差不多，但是毕竟结合了sybgreen，迁移率还是不一样的，只是示意一下的

谢谢您，我先做Q-PCR产物的电泳，如果不行，我就再重新设计引物试试。
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5楼2011-07-25 20:45:06
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