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小雪sherry

金虫 (小有名气)

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[交流] 酶切连接转化

最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载体，转化后有蓝白斑，挑取白斑，提质粒，电泳大小也不对，怎么办啊，各位大侠给个意见啊，自己做了半年多了，感觉手法没问题，感受态一是买的，应该也没问题啊，为啥总做不好呢，快没信心了

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1楼 2011-07-09 09:24:11

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friya0910

新虫 (正式写手)

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★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎交流。我们实验室是菌落PCR不可靠……所以都用一种快速提质粒的方法看大小，再挑大的质粒去酶切验证。 2011-07-10 21:41:53

引用回帖:

Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-09 09:24:11:
最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载 ...

个人觉得提质粒跑电泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，确定目的片段连进去了，再提质粒的！最保险的还是测序验证一下比较好吧！

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7楼2011-07-10 19:16:16

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yang0071

木虫 (职业作家)

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★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 提了好多问题，都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金币+2): 做了阳性对照，确定感受态没有问题，连接体系15微升，T4连接酶，我觉得这些都没问题的啊，重新来一次吧 2011-07-11 07:56:58

做转化时，阳性对照呢？感觉很多时候是不准的

估计是连接效率低，连接体系是多少的？什么酶？时间？温度？
转化时加液量多少？热休克温控？时间？

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2楼2011-07-09 09:37:02

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