应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接转化
121/1返回列表
查看: 919  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小雪sherry

金虫 (小有名气)

[交流] 酶切连接转化

最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载体，转化后有蓝白斑，挑取白斑，提质粒，电泳大小也不对，怎么办啊 ，各位大侠给个意见啊，自己做了半年多了，感觉手法没问题，感受态一是买的，应该也没问题啊，为啥总做不好呢，快没信心了
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-07-09 09:24:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 提了好多问题，都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金币+2): 做了阳性对照，确定感受态没有问题，连接体系15微升，T4连接酶，我觉得这些都没问题的啊，重新来一次吧 2011-07-11 07:56:58
做转化时，阳性对照呢？  感觉很多时候是不准的

估计是连接效率低，连接体系是多少的？什么酶？时间？温度？
转化时 加液量多少？ 热休克温控？时间？
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-07-09 09:37:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 小虫很活跃啊 鼓励 2011-07-09 11:07:03
小雪sherry(金币+1): 同样的啊 我也是这样，连了好几次了，每次都是长了几个菌落，很郁闷 2011-07-11 08:01:29
我觉得应该是目的片段没有连接上吧，我最近也在做这个实验，不过我们的感受态是自己制备的，我们是用inoue法制备的超级感受态，目的片段都连到T载体上了。但是从T载体上切下来的目的片段往PMC18 质粒上也是不好连。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-07-09 09:53:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
小雪sherry(金币+1): 恩恩 有道理 2011-07-11 08:01:53
个人认为应该是连接的问题，你可以挑白色的单克隆进行先PCR验证，如果能够P出来，那么再提取质粒，进行酶切验证；

蓝白斑筛选长出来的单克隆不一定正确，挑白色单克隆划到平板上，划之前先在板子上涂一些X-Gal，这样也可以排除假阳性的。。。

祝实验顺利！
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-07-09 15:35:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
你片段用什么酶扩的？记住用Taq酶扩，千万别用高保真的酶，那样扩出来尾部是没有A的，所以没法连接T载体；T载体是买的还是自己做的？
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-07-09 15:46:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyhai

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-07-09 18:20:11
T载体上的目的片段经过测序没？电泳质粒通过大小判断不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有没有用T7引物进行PCR鉴定。还有就是分析目的片段中的限制内切酶位点。表达载体的鉴定也可以通过菌落PCR的方法来初步判断目的片段的插入情况。希望对你有帮助。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2011-07-09 15:48:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

friya0910

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎交流。我们实验室是菌落PCR不可靠……所以都用一种快速提质粒的方法看大小，再挑大的质粒去酶切验证。 2011-07-10 21:41:53
引用回帖:
Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-09 09:24:11:
最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载 ...

个人觉得提质粒跑电泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，确定目的片段连进去了，再提质粒的！最保险的还是测序验证一下比较好吧！
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2011-07-10 19:16:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:16:16:
个人觉得提质粒跑电泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，确定目的片段连进去了，再提质粒的！最保险的还是测序验证一下比较好吧！

我的片段是接近700了 应该能看出大小来的，我试试PCR吧，这样可以省点试剂盒提质粒
赞一下 回复此楼
8楼2011-07-11 08:05:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jiangyhai at 2011-07-09 15:48:36:
T载体上的目的片段经过测序没？电泳质粒通过大小判断不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有没有用T7引物进行PCR鉴定。还有就是分析目的片段中的限制内切酶位点。表达载体的鉴定也可以通过菌落PCR的方法来初步 ...

T载体的我还没有测过序，但是我用酶把片段从T载体上切下来了啊 如果没连上也应该切不下来啊 试试菌落pcr吧 谢谢
赞一下 回复此楼
9楼2011-07-11 08:07:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-09 15:46:10:
你片段用什么酶扩的？记住用Taq酶扩，千万别用高保真的酶，那样扩出来尾部是没有A的，所以没法连接T载体；T载体是买的还是自己做的？

用的是TAKARA的Tag酶，T 载体还能自己做吗，教教我吧，还省钱了
赞一下 回复此楼
10楼2011-07-11 08:09:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-09 09:53:07:
我觉得应该是目的片段没有连接上吧，我最近也在做这个实验，不过我们的感受态是自己制备的，我们是用inoue法制备的超级感受态，目的片段都连到T载体上了。但是从T载体上切下来的目的片段往PMC18 质粒上也是不好连。

不要丧失信心，多做几次，菌落pcr的时候多挑几个菌检测，加油！
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-07-11 08:46:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-11 08:09:13:
用的是TAKARA的Tag酶，T 载体还能自己做吗，教教我吧，还省钱了

你还是买成品的吧，自己做的质量没保证，再说商品化的也不值钱
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-07-11 21:07:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小雪sherry 的主题更新
121/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] FileCode能看出啥？ +8 要乐观耀哥 2026-08-10 23/1150 2026-08-13 00:35 by 要乐观耀哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +8 majunge000 2026-08-10 9/450 2026-08-12 22:17 by 虫友是什么虫
[基金申请] 不应该看fileCode +5 且听虎啸 2026-08-12 6/300 2026-08-12 16:26 by Tide man
[基金申请] filecode +13 documentary 2026-08-10 15/750 2026-08-12 15:56 by 云上清扬
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +4 工厂打螺丝 2026-08-08 4/200 2026-08-12 09:18 by hansi2025
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +3 布布和一二 2026-08-11 4/200 2026-08-11 15:20 by aasahr
[基金申请] 听说今天filecode变了 +26 布布和一二 2026-08-06 49/2450 2026-08-11 13:18 by WH3796
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 基金中了 +15 laoda193707 2026-08-06 15/750 2026-08-11 00:11 by jiafei2190
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭