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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接转化
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小雪sherry

金虫 (小有名气)

[交流] 酶切连接转化

最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载体，转化后有蓝白斑，挑取白斑，提质粒，电泳大小也不对，怎么办啊 ，各位大侠给个意见啊，自己做了半年多了，感觉手法没问题，感受态一是买的，应该也没问题啊，为啥总做不好呢，快没信心了
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1楼 2011-07-09 09:24:11
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 提了好多问题，都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金币+2): 做了阳性对照，确定感受态没有问题，连接体系15微升，T4连接酶，我觉得这些都没问题的啊，重新来一次吧 2011-07-11 07:56:58
做转化时，阳性对照呢？  感觉很多时候是不准的

估计是连接效率低，连接体系是多少的？什么酶？时间？温度？
转化时 加液量多少？ 热休克温控？时间？
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2楼2011-07-09 09:37:02
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青菜小虫

银虫 (著名写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 小虫很活跃啊 鼓励 2011-07-09 11:07:03
小雪sherry(金币+1): 同样的啊 我也是这样，连了好几次了，每次都是长了几个菌落，很郁闷 2011-07-11 08:01:29
我觉得应该是目的片段没有连接上吧，我最近也在做这个实验，不过我们的感受态是自己制备的，我们是用inoue法制备的超级感受态，目的片段都连到T载体上了。但是从T载体上切下来的目的片段往PMC18 质粒上也是不好连。
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3楼2011-07-09 09:53:07
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
小雪sherry(金币+1): 恩恩 有道理 2011-07-11 08:01:53
个人认为应该是连接的问题，你可以挑白色的单克隆进行先PCR验证，如果能够P出来，那么再提取质粒，进行酶切验证；

蓝白斑筛选长出来的单克隆不一定正确，挑白色单克隆划到平板上，划之前先在板子上涂一些X-Gal，这样也可以排除假阳性的。。。

祝实验顺利！
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4楼2011-07-09 15:35:17
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
你片段用什么酶扩的？记住用Taq酶扩，千万别用高保真的酶，那样扩出来尾部是没有A的，所以没法连接T载体；T载体是买的还是自己做的？
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5楼2011-07-09 15:46:10
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-07-09 18:20:11
T载体上的目的片段经过测序没？电泳质粒通过大小判断不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有没有用T7引物进行PCR鉴定。还有就是分析目的片段中的限制内切酶位点。表达载体的鉴定也可以通过菌落PCR的方法来初步判断目的片段的插入情况。希望对你有帮助。
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6楼2011-07-09 15:48:36
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friya0910

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎交流。我们实验室是菌落PCR不可靠……所以都用一种快速提质粒的方法看大小，再挑大的质粒去酶切验证。 2011-07-10 21:41:53
引用回帖:
Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-09 09:24:11:
最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载 ...

个人觉得提质粒跑电泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，确定目的片段连进去了，再提质粒的！最保险的还是测序验证一下比较好吧！
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7楼2011-07-10 19:16:16
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小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:16:16:
个人觉得提质粒跑电泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，确定目的片段连进去了，再提质粒的！最保险的还是测序验证一下比较好吧！

我的片段是接近700了 应该能看出大小来的，我试试PCR吧，这样可以省点试剂盒提质粒
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8楼2011-07-11 08:05:47
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小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jiangyhai at 2011-07-09 15:48:36:
T载体上的目的片段经过测序没？电泳质粒通过大小判断不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有没有用T7引物进行PCR鉴定。还有就是分析目的片段中的限制内切酶位点。表达载体的鉴定也可以通过菌落PCR的方法来初步 ...

T载体的我还没有测过序，但是我用酶把片段从T载体上切下来了啊 如果没连上也应该切不下来啊 试试菌落pcr吧 谢谢
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9楼2011-07-11 08:07:31
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小雪sherry

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-09 15:46:10:
你片段用什么酶扩的？记住用Taq酶扩，千万别用高保真的酶，那样扩出来尾部是没有A的，所以没法连接T载体；T载体是买的还是自己做的？

用的是TAKARA的Tag酶，T 载体还能自己做吗，教教我吧，还省钱了
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10楼2011-07-11 08:09:13
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青菜小虫

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-09 09:53:07:
我觉得应该是目的片段没有连接上吧，我最近也在做这个实验，不过我们的感受态是自己制备的，我们是用inoue法制备的超级感受态，目的片段都连到T载体上了。但是从T载体上切下来的目的片段往PMC18 质粒上也是不好连。

不要丧失信心，多做几次，菌落pcr的时候多挑几个菌检测，加油！
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11楼2011-07-11 08:46:20
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-11 08:09:13:
用的是TAKARA的Tag酶，T 载体还能自己做吗，教教我吧，还省钱了

你还是买成品的吧，自己做的质量没保证，再说商品化的也不值钱
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12楼2011-07-11 21:07:58
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