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小雪sherry

金虫 (小有名气)


[交流] 酶切连接转化

最近在做PET-28a与目的片段连接,首先目的片段是连T载体切下来的,然后把目的片段连到载体上,转化得到的菌落特别少,两三个,提质粒大小不对,做了半年这个试验了,怎么都做不好,急啊。还有最近做目的片段连T载体,转化后有蓝白斑,挑取白斑,提质粒,电泳大小也不对,怎么办啊 ,各位大侠给个意见啊,自己做了半年多了,感觉手法没问题,感受态一是买的,应该也没问题啊,为啥总做不好呢,快没信心了
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小雪sherry(金币+1):谢谢参与
你片段用什么酶扩的?记住用Taq酶扩,千万别用高保真的酶,那样扩出来尾部是没有A的,所以没法连接T载体;T载体是买的还是自己做的?
5楼2011-07-09 15:46:10
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yang0071

木虫 (职业作家)


★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 提了好多问题,都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金币+2): 做了阳性对照,确定感受态没有问题,连接体系15微升,T4连接酶,我觉得这些都没问题的啊,重新来一次吧 2011-07-11 07:56:58
做转化时,阳性对照呢?  感觉很多时候是不准的

估计是连接效率低,连接体系是多少的?什么酶?时间?温度?
转化时 加液量多少? 热休克温控?时间?
2楼2011-07-09 09:37:02
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青菜小虫

银虫 (著名写手)


★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 小虫很活跃啊 鼓励 2011-07-09 11:07:03
小雪sherry(金币+1): 同样的啊 我也是这样,连了好几次了,每次都是长了几个菌落,很郁闷 2011-07-11 08:01:29
我觉得应该是目的片段没有连接上吧,我最近也在做这个实验,不过我们的感受态是自己制备的,我们是用inoue法制备的超级感受态,目的片段都连到T载体上了。但是从T载体上切下来的目的片段往PMC18 质粒上也是不好连。
3楼2011-07-09 09:53:07
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小雪sherry(金币+1):谢谢参与
小雪sherry(金币+1): 恩恩 有道理 2011-07-11 08:01:53
个人认为应该是连接的问题,你可以挑白色的单克隆进行先PCR验证,如果能够P出来,那么再提取质粒,进行酶切验证;

蓝白斑筛选长出来的单克隆不一定正确,挑白色单克隆划到平板上,划之前先在板子上涂一些X-Gal,这样也可以排除假阳性的。。。

祝实验顺利!
4楼2011-07-09 15:35:17
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