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小雪sherry

金虫 (小有名气)

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[交流] 酶切连接转化

最近在做PET-28a与目的片段连接，首先目的片段是连T载体切下来的，然后把目的片段连到载体上，转化得到的菌落特别少，两三个，提质粒大小不对，做了半年这个试验了，怎么都做不好，急啊。还有最近做目的片段连T载体，转化后有蓝白斑，挑取白斑，提质粒，电泳大小也不对，怎么办啊，各位大侠给个意见啊，自己做了半年多了，感觉手法没问题，感受态一是买的，应该也没问题啊，为啥总做不好呢，快没信心了

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1楼 2011-07-09 09:24:11

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jiangyhai

金虫 (著名写手)

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★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-07-09 18:20:11

T载体上的目的片段经过测序没？电泳质粒通过大小判断不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有没有用T7引物进行PCR鉴定。还有就是分析目的片段中的限制内切酶位点。表达载体的鉴定也可以通过菌落PCR的方法来初步判断目的片段的插入情况。希望对你有帮助。

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6楼2011-07-09 15:48:36

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yang0071

木虫 (职业作家)

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★ ★ ★
小雪sherry(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 提了好多问题，都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金币+2): 做了阳性对照，确定感受态没有问题，连接体系15微升，T4连接酶，我觉得这些都没问题的啊，重新来一次吧 2011-07-11 07:56:58

做转化时，阳性对照呢？感觉很多时候是不准的

估计是连接效率低，连接体系是多少的？什么酶？时间？温度？
转化时加液量多少？热休克温控？时间？

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2楼2011-07-09 09:37:02

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